姚清侠
- 作品数：22 被引量：98H指数：7
- 供职机构：华中农业大学畜牧兽医学院更多>>
- 发文基金：湖北省科技攻关计划国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪瘟弱毒C81株全基因组测序及分子结构预测
- 2005年
- 参照已发表的猪瘟病毒弱毒株的序列,设计7对覆盖全长基因组的引物,通过RT-PCR从感染猪瘟病毒弱毒株的PK-15细胞中扩增得到7个cDNA片段,分别克隆到pMD18-T载体并测序,利用DNASIS软件获得猪瘟病毒C81株全基因组序列(GenBank:AY663656).C81株基因组全长12310nt,只有一个大的开放阅读框,编码3898个氨基酸的聚蛋白.序列分析表明,C81株开放阅读框与其它各毒株核苷酸和氨基酸序列的同源性变化较大,分别为84.4%～99.6%和91.6%～99.4%.同时,我们绘制了26株CSFV ORF的进化树,比较了CSFV 5'非翻译区核苷酸序列并推测其二级结构,发现不同毒株之间存在较大的差异,另外对C81株聚蛋白的功能域和三维结构进行了预测.
- 徐卓菲钱平李祥敏郭东春姚清侠陈焕春
- 关键词：猪瘟病毒同源建模
- 猪瘟病毒非结构蛋白NS2基因不同片段的克隆及在原核系统中的高效表达
- 参照猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计并合成一组引物。从已构建含有猪瘟病毒兔化弱毒株全基因组质粒pMCfT1-6中分别扩增出NS2长1389bp和876bp的片段。将扩增的不同长度的NS2基因序列克隆至...
- 郭东春钱平李祥敏徐卓菲姚清侠金梅林陈焕春
- 关键词：猪瘟病毒NS2基因原核表达
- 文献传递
- 猪γ-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒作用被引量：12
- 2008年
- 为了获得高效分泌表达重组猪γ-干扰素(rPoIFNγ) ,将去除信号肽的编码梅山猪γ-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNγ)插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC 9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC 9K-mPoIFNγ。将线性化的pPIC9K-mPoIFNγ以化学方法(LiCl)转化入毕赤酵母菌株GS115(组氨酸缺陷型) ,转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,以G418(4 g/L)筛选到多拷贝菌株。SDS-PAGE和Western-blot检测结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出17 000和23 000左右的mPoIFNγ特异蛋白,其表达量约为120 mg/L,占分泌型总蛋白的65 %;细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,结果表明rPolIFNγ具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为1.67×106U/mg。
- 姚清侠黄勤锋曹毅司有辉钱平陈焕春
- 关键词：猪Γ-干扰素毕赤酵母分泌表达抗病毒活性
- 猪β-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其活性被引量：8
- 2007年
- 为了高效表达分泌型的猪β-干扰素,将去除信号肽的编码梅山猪β-干扰素成熟多肽基因（mPoIFNβ）插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC9K,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNβ。将以SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFNβ用化学方法（LiCl）,与鲑鱼精DNA（ssDNA）共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后获得阳性菌株,再经高浓度G418筛选到多拷贝菌株。以1%甲醇连续诱导4 d,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明：表达产物为22 ku和26 ku的混合物,在GS115中的表达量约为80 mg/L,占分泌型总蛋白的29.4%-30.8%,表明猪β-干扰素基因在毕赤酵母中获得了高效分泌表达。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸（pH2）,对热（56℃）部分敏感,并能被特异性的抗猪β-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。以细胞病变抑制法（CPE50）测定干扰素抗病毒活性,在MDBK（牛肾细胞系）中表达的猪β-干扰素的抗VSV比活性达到2.0×10^6U/mg;对口蹄疫病毒在IBRS-2细胞中的增殖也有明显的抑制作用。
- 姚清侠曹毅钱平徐卓菲何雁南司有辉陈焕春
- 关键词：毕赤酵母分泌表达抗病毒活性口蹄疫病毒
- 嵌合猪圆环病毒PCV2-1感染性克隆的构建被引量：6
- 2007年
- 根据GenBank中发表的猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)的核苷酸序列,设计3对特异性引物。通过PCR方法,以引物P1和P2从接毒细胞中扩增到猪型圆环病毒(PCV2)全基因组,克隆入pBluescriptⅡ SK(+)载体构建质粒SK-PCV2,以之为模板,用引物P5和P6扩增不包含PCV2-ORF2的部分基因(SK-PCV2△ORF2);另一对引物P3、P4用于特异性扩增猪型圆环病毒(PCV1)的ORF2基因,与前面得到的SK-PCV2△ORF2基因连接,构建嵌合型质粒SK-PCV2-1,以此为基础构建双联体质粒SK-PCV2-1(DB)。体外转染PK-15细胞,盲传4代后,用RT-PCR和间接免疫荧光方法检测,结果表明本试验构建的嵌合病毒PCV2-1克隆具有感染性。
- 刘新文姚清侠曹胜波郭东春陈焕春
- 关键词：感染性克隆
- 口蹄疫病毒VP1-3免疫表位基因与猪γ-干扰素基因的融合表达被引量：7
- 2007年
- 将人工合成的口蹄疫病毒VP1-3上的抗原表位基因和猪γ-干扰素基因串联入原核表达载体pGEX-KG中,经酶切鉴定及测序表明重组载体中二者以接头融合的形式构建成重组表达质粒。将该质粒转化BL21后经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白的高效表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,重组蛋白分子量约为66 Ku,与预期大小相符。薄层扫描分析显示表达的重组蛋白占菌体总蛋白的37.4%,且主要以包涵体的形式存在。包涵体以SKL变性后,经PEG4000、氧化型谷胱苷肽和还原型谷胱苷肽复性。粗提产物以CPE_(50)测得重组蛋白在MDBK细胞上的抗水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的活性达到1600 U/mL,说明表达产物具有干扰素的生物学活性,为下一步基因工程疫苗的研究奠定了基础。
- 姚清侠钱平曹毅郭东春徐卓菲何雁南司有辉陈焕春
- 关键词：口蹄疫病毒抗原表位猪Γ-干扰素
- 携带猪γ干扰素基因逆转录病毒载体的构建及其在猪肾细胞(PK-15)中的表达被引量：3
- 2007年
- 将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/106cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。
- 姚清侠刘新文钱平郭东春陈焕春
- 关键词：猪Γ干扰素逆转录病毒PK-15细胞抗病毒活性水泡性口炎病毒
- 口蹄疫病毒VP1-3免疫表位基因与猪γ-干扰素基因的融合表达
- 将人工合成的口蹄疫病毒VP1-3上的抗原表位基因和猪γ-干扰素基因串联入原核表达载体pGEX-KG中,经酶切鉴定及序列测序表明重组载体中二者以接头融合的形式构建成重组表达质粒。将该质粒转化BL21后经IPTG诱导,实现了...
- 姚清侠钱平曹毅徐卓菲何雁南司有辉陈焕春
- 关键词：口蹄疫病毒抗原表位猪Γ-干扰素
- 文献传递
- 检测猪瘟抗体间接ELISA方法的建立及应用被引量：11
- 2007年
- 用猪肾传代细胞PK-15增殖猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒苗株(HCLV),病毒培养上清液经硫酸铵沉淀、浓缩后作为包被抗原。经各种条件的优化,建立了检测猪瘟血清抗体的间接ELISA。所建立的间接ELISA抗原最佳包被浓度分22.28mg/L,血清最佳稀释度为1:40,与猪细小病毒、O型口蹄疫、猪衣原体阳性血清呈阴性反应,与HCV标准阳性血清、免疫猪血清和临床发病猪血清呈明显的阳性反应;与标准阴性血清和临床未感染CSFV的猪血清呈阴性反应;用HI和本ELISA方法检测94个猪厂送检血清1455份。其中血清稀释液中不含PEG6000的914份送检血清阳性率为83.7%,与HI符合率为96.6%,HI阳性率略高为85.7%;血清稀释液中含2% PEG6000的541份送检血清阳性率为88.72%,与HI符合率为97.3%,HI阳性率为88.17%。结果表明本试验所建立的间接ELISA具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点,可用于临床猪瘟血清抗体的定性和定量检测。
- 何雁南栾后利董晓辉曹毅姚清侠刘正飞陈焕春
- 关键词：猪瘟ELISA
- 猪瘟病毒非结构蛋白NS2基因不同片段的克隆及在原核系统中的高效表达
- 参照猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计并合成一组引物.从已构建含有猪瘟病毒兔化弱毒株全基因组质粒pMCfT1-6中分别扩增出NS2长1389bp和876bp的片段.将扩增的不同长度的NS2基因序列克隆至...
- 郭东春钱平李祥敏徐卓菲姚清侠金梅林陈焕春
- 关键词：猪瘟病毒NS2基因原核表达家畜病毒学
- 文献传递
