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胞壁酰二肽激活小鼠原代肝窦内皮细胞中NOD2信号被引量：1: 2014年; 目的调查小鼠原代肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)中NOD2信号通路激活后产生的免疫应答效应。方法使用胶原酶灌注方法结合percoll密度梯度离心加抗小鼠LSEC免疫磁珠分离纯化小鼠LSEC。定量PCR检测小鼠原代LSEC NOD1和NOD2 mRNA表达水平,同时给胞壁酰二肽刺激小鼠原代LSEC;定量PCR检测NOD2、RIP2、TNF-α和IL-6mRNA表达水平;定量ELISA检测细胞上清IL-6和TNF-α蛋白产量。结果小鼠原代LSEC中NOD2基础表达水平相对于NOD1基础表达水平较低。胞壁酰二肽刺激LSEC后诱导NOD2及其下游分子RIP2表达水平上调,接着诱导产生IL-6效应分子,而没有诱导产生TNF-α等其它细胞因子和趋化因子。结论胞壁酰二肽能够激活小鼠LSEC中NOD2介导的信号通路,并诱导产生IL-6效应分子,可能在维持肝脏内环境稳定中发挥着重要作用。; 陈明发孙潺林永夏幼辰杨东亮吴珺; 关键词：NOD2 肝窦内皮细胞胞壁酰二肽信号通路

中国人群HLA-Ⅰ类分子参与HCV1b型免疫逃逸突变的机制研究: 目的由于缺乏预防性疫苗且治疗费用昂贵,慢性丙型病毒性肝炎仍然是世界范围内重大的公共卫生难题。目前丙型肝炎病毒(hepatitis C, HCV)感染慢性化机制尚不明确,有研究表明CD8+T细胞应答失败可能为HCV感染慢性...; 夏幼辰; 关键词：HLA-I类分子 CTL应答

树鼩（Tupaia belangeri）ISG15分子全长克隆及分子生物学功能分析: 2014年; 目的对丙型病毒性肝炎（hepatitis C virus，HCV）小动物模型树嗣的干扰素刺激基因15（interferon stimulated gene15，ISG15）分子的全长eDNA序列进行克隆及分子生物学功能分析，为树晌模型在HCV感染天然免疫中的研究提供分子生物学基础。方法根据Genbank中灵长类及其他哺乳类动物ISG15分子序列保守区设计引物，使用SmarterRace方法扩增树购ISG15全长序列。在序列两端设计特异性引物，引入酶切位点，进行全长片段扩增。全长PCR产物纯化回收后连接至pMD18-T载体，构建重组质粒pMD18-T-tbISG15。对重组质粒进行酶切鉴定、测序。对序列进行同源性及种系进化，同时使用SWISSMODEL同源建模方法进行蛋白二级、三级结构预测及功能分析。结果获得树购ISG15全长序列共687bp，编码157个氨基酸。树晌ISG15与其他哺乳动物ISG15高度同源，与人的核苷酸及氨基酸序列同源性分别高达72．99％及71．34％，核苷酸及氨基酸序列进化树分析均显示树嗣种系最为接近灵长类动物。结构域分析提示：树嗣ISG15主要由两个类泛素样结构域构成。软件预测所得树购ISG15三维结构与人ISG15三维结构高度相似，且具有类泛素样三维结构，动力学检测提示本试验预测的树嗣ISG15三维结构稳定，可信度高。结论对树胸ISG15的克隆进一步完善了对树购模型的认识。为进一步在体内研究HCV感染的天然免疫机制奠定了分子生物学基础。; 夏幼辰吴珺高珊赵西平杨东亮; 关键词：树鼩丙型病毒性肝炎天然免疫

中国人群HLA-I类分子参与HCV1b型免疫逃逸突变的机制研究: 目的：　　由于缺乏预防性疫苗且治疗费用昂贵，慢性丙型病毒性肝炎仍然是世界范围内重大的公共卫生难题。目前丙型肝炎病毒（hepatitis C，HCV）感染慢性化机制尚不明确，有研究表明CD8+T细胞应答失败可能为HCV感染...; 夏幼辰; 关键词：丙型肝炎病毒 HLA-I类分子 CTL应答; 文献传递

Toll样受体介导小鼠原代肝细胞产生的天然免疫应答及其对乙型肝炎病毒复制的抑制作用被引量：9: 2011年; 目的探讨肝细胞的Toll样受体（TLR）信号途径及其诱导的抗病毒免疫应答。方法分离野生型C57BL／6小鼠的原代肝细胞，定量逆转录一聚合酶链反应法检测TLR的表达。分别用TLR1～9配体刺激肝细胞并收集细胞上清液。酶联免疫吸附法检测细胞上清液内的细胞因子。病毒保护实验检测细胞上清液的抗脑膜炎心肌炎病毒因子，并将细胞上清液与HBV-Met细胞共孵育，用Southernblot法检测其对HBV复制的抑制效应。结果原代肝细胞能表达TLR1～9。与其TLR表达谱相应的，肝细胞在TLR1～9配体的刺激下均可以产生炎性细胞因子（肿瘤坏死因子α和白细胞介素6），而仅在TLRl、TLR3、TLR7和TLR9配体刺激下可产生I型干扰素（干扰素α和干扰素β）。在病毒保护实验中，TLR3和TLR7的配体可以刺激肝细胞产生大量的抗脑膜炎心肌炎病毒效应分子；而TLRl、TLR3和TLR4配体直接刺激的肝细胞上清液，以及TLR3、TLR7和TLR9配体转染刺激的肝细胞上清液，都能有效抑制HBV的复制。结论小鼠原代肝细胞有独特的TLR信号途径，并能通过TLR配体的激活产生抑制HBV复制的效应。这一发现对于制定基于TLR的抗肝脏靶向性病毒的治疗措施有指导意义。; 吴珺陈明发夏幼辰郭艳林永孙潺张春燕陈妍刘慎沛郝友华陆蒙吉JorgF.Schlaak杨东亮; 关键词：肝细胞 TOLL样受体免疫肝炎病毒

丙型肝炎病毒1b型NS3基因扩增方案的改进: 2012年; 目的优化扩增武汉地区HCV1b型患者HCV非结构蛋白3(NS3)的cDNA,并进行测序。方法从患者血清中提取HCVRNA,采用型特异性引物扩增分型法检测HCV患者基因分型。设计3对外侧引物和3对内侧引物,采用套式PCR技术(方案一)分别扩增HCV1b型患者的HCVNS33个区段,然后用3对内侧引物进行测序。为了优化NS3扩增和测序效果和减少操作繁琐,对引物进行改进,设计1对外侧引物和1对内侧引物,采用改进的套式PCR技术(方案二)直接扩增HCV1b型患者的HCVNS3区,然后用3个正向引物和1个逆向引物进行测序。结果改进的套式PCR技术(方案二)与套式PCR技术(方案一)相比,操作较为简单,而且扩增效率增高,扩增效果较好。结论采用改进的套式PCR技术(方案二)扩增和测序HCVNS3区更迅速、有效、实用。; 柯晓煜丁红晖郭燕陈明发林永夏幼辰孙潺杨东亮吴珺; 关键词：HCV NS3 套式PCR

干扰素-γ基因敲除小鼠慢性乙型肝炎病毒复制模型的建立被引量：2: 2013年; 目的:建立干扰素-(interferon-,IFN-)基因敲除小鼠慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制模型.方法:IFN-基因敲除(IFN--/-)小鼠繁育并抽提组织DNA进行聚合酶链反应(PCR)及凝胶电泳鉴定基因型.IFN--/-小鼠纯合子9只与野生型C57BL/6小鼠9只同时高压水注射pAAV/HBV1.2质粒,按既定时间点采血检测乙型肝炎表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)、乙型肝炎e抗原(hepatitis B virus e antigen,HBeAg)和HBV DNA.血清HBsAg和HBeAg表达水平由电化学发光法进行定量检测.经抽提血清总DNA后,血清HBV DNA由定量PCR进行检测.结果:本实验室繁殖的IFN--/-小鼠均为纯合子基因型.IFN--/-小鼠和野生型C57BL/6小鼠血清中HBsAg、HBeAg和HBV DNA持续存在,转染后第40天仍阳性.但是,IFN--/-小鼠血清HBsAg表达水平高于C57BL/6野生小鼠(40天时,P=0.042);IFN--/-小鼠血清HBV DNA持续高水平复制,明显高于C57BL/6野生小鼠(第25天时,P=0.012;第40天时,P=0.039).两组小鼠血清HBeAg表达水平无差异.结论:IFN--/-小鼠慢性HBV复制模型成功建立,并揭示了IFN-在慢性HBV感染中可抑制HBV复制.; 陈明发夏幼辰林永孙潺杨东亮吴珺; 关键词：IFN-Γ 慢性乙型肝炎动物模型

湖北地区119例 HCV 1b 型 NS3丝氨酸蛋白酶区的序列变异研究: 2015年; 目的：分析丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）1b 型非结构蛋白3（non-structure protein 3, NS3）丝氨酸蛋白酶区序列的变异规律及影响意义。方法使用基因型别特异性引物,通过巢式 PCR 的方法扩增119例慢性 HCV 1b 型患者血清中 HCV NS3区。对 PCR 产物进行测序后获得 NS3区核苷酸及氨基酸序列。分析119例 HCV 1b 型 NS3区序列的同源性及种系进化,分析 NS3丝氨酸蛋白酶区的变异情况及重要功能位点的突变情况。结果湖北地区 HCV 1b 型与 HCV 1b 型标准株及亚洲地区序列同源性较高,核苷酸序列同源性为85.94％及87.68％,氨基酸序列同源性可达96.83％及92.39％,而与欧美地区1b 型同源性较低,核苷酸序列同源性均为85.57％,氨基酸序列同源性分别为92.17％及93.38％。进化树分析提示湖北地区序列与中国其他地区序列亲缘性较接近,而与日本、东南亚地区及欧美地区的1b 型亲缘性较远。 NS3丝氨酸蛋白酶区185个氨基酸内有34个位点有氨基酸突变,但其重要的功能区包括催化酶底物特异性结合位点以及 Zn2﹢结合位点在所有序列中均高度保守,无一例发生突变。结论对湖北地区 HCV 1b型 NS3丝氨酸蛋白酶区的变异规律及生物学意义的研究进一步丰富和完善了对 HCV 1b 型基因组变异情况的认识。为了解 HCV1b 型在中国地区的进化过程提供一定理论基础。; 夏幼辰潘雯柯晓煜王华卢银平郑昕揭盛华何生松吴郡杨东亮; 关键词：丙型肝炎病毒 NS3

CXCR3基因敲除小鼠慢性乙型肝炎病毒复制模型的建立被引量：1: 2012年; 目的建立CXCR3基因敲除小鼠慢性乙型肝炎病毒复制模型。方法繁育CXCR3基因敲除小鼠,并抽提组织DNA进行聚合酶链反应及凝胶电泳鉴定基因型。CXCR3基因敲除小鼠纯合子9只与野生型C57BL/6小鼠9只同时高压水注射pAAV/HBV1.2质粒,按既定时间点采血检测HBsAg、HBeAg、HBV DNA,以及取肝组织行免疫组织化学检测HBcAg表达。结果本实验室繁殖的CXCR3基因敲除小鼠均为纯合子基因型。在pAAV/HBV1.2质粒转染后第1天,CXCR3基因敲除小鼠与野生型C57BL/6小鼠血清HBsAg水平分别为1134.69±244.42和1759.63±881.20(P=0.096);第4天分别为5305.29±1395.06和7493.29±658.63(P=0.003);第15天分别为1615.04±1187.16和1536.19±1046.02(P=0.905);第40天为229.45±79.27和228.19±295.02(P=0.996);第1天血清HBeAg水平分别为6.65±1.50和20.61±4.03(P=0.000);第4天为6.33±1.61和9.79±2.31(P=0.007);第15天为3.52±1.97和2.85±0.74(P=0.425);第40天为1.28±0.06和1.90±1.01(P=0.431);第10天血清HBVDNA水平分别为4.38±0.22 lgcopies/ml和6.56±0.16lgcopies/ml(P=0.008);第15天为4.41±0.88lgcopies/ml和5.69±0.04lgcopies/m(l P=0.177);第25天为4.48±0.04lgcopies/ml和6.44±0.16lgcopies/ml(P=0.004);第40天为3.66±0.45lgcopies/ml和5.20±0.28lgcopies/ml(P=0.055);两组血清HBV DNA持续存在,在转染后第40天仍为阳性。肝组织HBcAg持续阳性,在转染后第4天、15天和40天均呈高表达,但CXCR3基因敲除小鼠肝组织HBcAg表达较低。结论我们成功建立了CXCR3基因敲除小鼠慢性HBV复制模型,可用于进一步研究CXCR3基因及其配体与HBV感染的关系。; 陈明发吴珺夏幼辰林永孙潺杨东亮; 关键词：慢性乙型肝炎 CXCR3 趋化因子

乙肝病毒感染动物模型喜马拉雅旱獭IL-15分子的克隆及序列分析被引量：1: 2014年; 目的对新近建立的乙肝病毒感染动物模型喜马拉雅旱獭的白细胞介素-15(IL-15)分子进行克隆和序列分析。方法抽提喜马拉雅旱獭脾脏总RNA,RT-PCR扩增旱獭IL-15cDNA序列,克隆至pMD18-T载体,制备重组质粒酶切、基因测序鉴定。利用软件分析旱獭IL-15与其他哺乳动物IL-15的同源性、种系亲缘关系,并预测蛋白结构。结果 RT-PCR扩增获得大小为489bp的序列,编码162个氨基酸。旱獭IL-15和土拨鼠IL-15同源性最高,和大鼠同源性最低。种系进化树结果提示旱獭IL-15与土拨鼠IL-15亲缘关系最近。旱獭IL-15蛋白构象与土拨鼠IL-15空间构象非常相似。结论克隆了喜马拉雅旱獭IL-15完整编码序列,为更好地利用新型乙肝病毒感染动物模型喜马拉雅旱獭奠定了基础。; 朱彬朱珍妮李安意杨雪晟陶元清夏幼辰黄顺梅宋志韬王忠东王宝菊陆蒙吉杨东亮; 关键词：喜马拉雅旱獭白细胞介素-15

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