陈继凤
- 作品数：15 被引量：60H指数：5
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- 人脐带Wharton胶细胞外基质对软骨种子细胞的作用被引量：1
- 2013年
- 目的观察人脐带Wharton胶细胞外基质(hWJECM)对兔软骨细胞增殖的影响。方法用差速离心法制作hWJECM,制成0.5%浓度浆料分别铺于六孔细胞培养板和96孔细胞培养板上,形成1 mm厚的薄膜,包被有此膜的培养板作为试验组,未铺膜单纯培养液组作为空白对照组,在培养板上培养兔关节软骨细胞。通过倒置显微镜观察,甲苯胺蓝染色观察两个组的兔软骨细胞5,10,15天的生长形态和增殖情况,用CCK8细胞增殖实验比较两组的1、3、5、7 d的增殖情况,来评估软骨种子细胞的增殖和表型维持情况。结果倒置显微镜观察5、10、15 d的细胞增殖情况好于单纯培养液组,5、15 d的甲苯胺蓝染色的结果也证明这个观点,CCK8细胞增殖试验1,3天时试验组和对照组的增殖没有明显的统计学差异(P=0.7142;P=0.0657),第5,7天显示hWJECM组在细胞增殖方面明显地优于单纯培养液的对照组(P=0.0001;P=0.0006)。结论 hWJECM免疫原性低,无细胞毒性作用,能够很好地促进软骨细胞的增殖。
- 高钺刘舒云黄靖香郭维民陈继凤张莉赵斌彭江汪爱媛王玉许文静卢世璧郭全义
- 关键词：细胞外基质脐带软骨细胞细胞增殖
- 神经来源天然细胞外基质的制备方法及生物相容性评价被引量：3
- 2010年
- 目的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)因其良好的生物安全性和生物相容性,以及具有细胞识别及黏附位点等优势而广泛用作组织工程支架材料。探讨神经来源天然ECM的制备方法及用于神经组织工程支架的可行性。方法收集新鲜犬坐骨神经10根,采用低渗冻融、机械粉碎、差速离心法制备神经ECM。采用扫描电镜观察其形态特征;Ⅰ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白免疫荧光染色观察其组成成分,并用Hoechst33258荧光染色检测其去细胞程度;行天狼猩红、番红O、甲苯胺蓝染色,对其成分进行定性分析;采用生化定量检测神经ECM中总胶原和葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)的含量;将大鼠背根神经节和大鼠雪旺细胞分别与神经ECM膜共培养,采用免疫荧光染色观察神经组织以及细胞在ECM膜上的生物相容性。结果扫描电镜观察示神经ECM为直径30～130nm的二维纳米微丝。免疫荧光染色示Ⅰ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白染色均呈阳性;Hoechst33258荧光染色提示神经ECM去细胞完全。组织化学染色示天狼猩红、番红O、甲苯胺蓝染色均呈阳性。生化成分定量检测神经ECM总胶原含量为(114.88±13.33)μg/mg干重,与正常神经组织的(54.07±5.06)μg/mg干重比较,差异有统计学意义(P<0.01);神经ECM的GAG含量为(17.52±2.34)μg/mg干重,与正常神经组织的(25.25±1.56)μg/mg干重比较,差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠背根神经节培养7d后,可见神经丝蛋白200免疫荧光染色呈阳性;大鼠雪旺细胞培养2d后,可见S100免疫荧光染色呈阳性。结论神经ECM富含Ⅰ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白等成分,具有良好的细胞相容性,可作为一种理想的神经组织工程支架材料。
- 王玉彭江赵喆黄靖香赵斌张莉眭翔许文静陈继凤卢世璧
- 关键词：神经组织工程细胞外基质生物相容性背根神经节雪旺细胞
- 人脱细胞软骨细胞外基质对异种软骨种子细胞的影响被引量：2
- 2014年
- 目的观察人脱细胞软骨细胞外基质(hACAM)对异种兔软骨种子细胞增殖和表型的影响。方法将差速梯度离心法制作的人脱细胞软骨细胞外基质,配制成0.5%的浆料,分别铺于6孔细胞培养板和96孔细胞培养板,形成1 mm厚的薄膜,以此培养板为实验组。空白对照组培养板仅使用单纯培养液培养。在培养板上培养兔关节软骨细胞。通过hochest33258染色验证人软骨细胞外基质脱细胞完全与否;分别在第5、15天两个时间点,通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色观察两种培养方法的兔软骨细胞的生长形态、细胞表型和增殖情况,用CCK-8细胞增殖实验比较两种培养方法在第1、3、7、10天的增殖情况。结果通过hochest33258染色发现差速梯度离心的人软骨细胞外基质脱细胞完全。通过倒置显微镜观察第5和15天的实验组细胞增殖情况优于空白对照组,甲苯胺蓝染色的结果也证明这个观点;CCK-8细胞增殖试验显示第7天hACAM组在细胞增殖方面明显地优于单纯培养液的对照组(P=0.0298),hACAM组的软骨细胞与空白组的软骨细胞在第10天的增殖情况相比没有统计学差异。结论 hACAM免疫原性低,无细胞毒性,能够很好地促进异种软骨细胞的增殖。
- 高钺刘舒云黄靖香郭维民陈继凤张莉赵斌彭江汪爱媛王玉许文静卢世璧郭全义
- 关键词：细胞外基质软骨软骨细胞细胞增殖
- 绿色荧光蛋白和Nel1型蛋白基因共表达腺病毒载体的构建及体外转染大鼠BMSCs的初步实验研究被引量：6
- 2010年
- 目的构建同时表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因和人类Nel1型蛋白[homo sapiens NEL-like1,NELL1)]基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-NELL1,并转染大鼠BMSCs,观察其表达情况,为进一步研究NELL1蛋白的成骨作用提供理论基础。方法设计特异性引物从NELL1质粒中扩增NELL1,将测序正确的片段用XhoI/BglII酶切处理,定向插入至pShuttle-GFP-CMV(-)TEMP重组穿梭载体,然后将验证正确的重组穿梭质粒中的插入片段转移至pAdxsi载体构建重组腺病毒载体质粒,用PacI限制性内切酶线性化后转染HEK293细胞,扩增纯化重组腺病毒,半数组织培养感染量法测定重组腺病毒滴度。培养大鼠BMSCs,采用流式细胞仪鉴定表面标志物,并行成骨、成脂诱导鉴定。用构建的pAdxsi-GFP-NELL1及空病毒pAdxsi-GFP(作为对照)转染鉴定正确的BMSCs,RT-PCR检测NELL1的表达,免疫荧光检测GFP基因及NELL1的表达情况,细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测对细胞增殖的影响。结果成功构建同时表达NELL1和GFP基因的重组腺病毒载体(pAdxsi-GFP-NELL1),纯化后获得滴度达1×1011pfu/mL的重组腺病毒。成功分离获得大鼠BMSCs并传代、纯化,经流式细胞仪鉴定表面标志物及成骨、成脂诱导鉴定为BMSCs。pAdxsi-GFP-NELL1转染BMSCs后,RT-PCR检测示NELL1mRNA阳性表达,荧光显微镜观察示细胞爬片GFP阳性表达,NELL1抗体免疫荧光观察示NELL1蛋白阳性表达。CCK-8法鉴定显示转染后对BMSCs生长无明显影响。结论构建并纯化后的重组腺病毒载体(pAdxsi-GFP-NELL1)可高效转染大鼠BMSCs,并稳定表达NELL1和GFP两种基因,为进一步研究新的成骨基因NELL1的作用,追踪其在体内、体外表达情况提供了新工具。
- 薛静彭江张莉刘舒云陈继凤汪爱媛袁玫许文静卢世璧
- 关键词：BMSCS重组腺病毒载体绿色荧光蛋白
- 神经来源天然细胞外基质的制备方法及生物相容性评价
- 王玉卢世璧彭江赵喆黄靖香赵斌张莉眭翔许文静陈继凤
- 软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架和骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨被引量：11
- 2010年
- [目的]探讨软骨细胞外基质和壳聚糖制备复合多孔支架,同时并对小鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨的可行性进行观察。[方法]以猪关节软骨细胞外基质和壳聚糖为原料,采用冷冻干燥法制备软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架。通过扫描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率,MTT方法检测支架浸提液毒性。将小鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养并用TGF-β1成软骨诱导后,与材料复合培养,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况。[结果]软骨细胞外基质/壳聚糖复合支架具有疏松多孔结构,孔径大小(159±36)μm,孔隙率为90.5%±2.3%,复合支架中的软骨细胞外基质成分甲苯胺蓝染色、番红O染色均呈阳性,MTT结果显示支架无细胞毒性。诱导的骨髓间充质干细胞在支架表面生长良好。[结论]软骨细胞外基质/壳聚糖复合材料具有合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好,是组织工程软骨的良好支架载体。
- 王玉彭江张莉陈继凤周晓涵黄靖香许文静郭全义卢世璧
- 关键词：壳聚糖软骨
- 化学去细胞异体神经添加不同组织来源雪旺细胞对周围神经损伤修复的功能评价被引量：10
- 2010年
- 目的构建不同组织来源雪旺细胞(Schwann cells,SCs)及化学去细胞异体神经(chemically extracted acellular nerve allograft,CEANA)移植物,比较其修复周围神经缺损的效果。方法 4周龄SD大鼠3只,体重80～120g,体外培养、扩增和鉴定BMSCs及脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)。体外诱导BMSCs和ADSCs分化为类雪旺细胞(dMSC,dADSC),并采用胶质细胞标记物p75和抗胶原纤维酸性蛋白(glial fi brillary acidic protein,GFAP)进行鉴定。取出生3d SD大鼠10只,体重6～8g,分离培养SCs。20只成年Wistar大鼠,体重200～250g,取双侧约20mm坐骨神经制备CEANA。40只成年雄性SD大鼠,制备左侧15mm坐骨神经缺损模型,根据神经缺损修复方法不同随机分为5组(n=8):A组,取自体坐骨神经翻转后吻合;B组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个SCs;C组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个dMSC;D组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个dADSC;E组,取15mm CEANA吻合。术后12周行感觉和运动功能恢复评价及组织学评价。结果 BMSCs和ADSCs表面抗原标志为CD34-、CD45-、CD90+。经诱导后BMSCs和ADSCs形态变化与SCs相似,呈双极、星形结构,SCs标记物p75和GFAP均表达阳性。术后12周,A、B、C、D、E组肢体50%回缩阈值分别为(13.8±2.3)、(15.4±6.5)、(16.9±5.3)、(16.3±3.5)和(20.0±5.3)g,A组与E组比较差异有统计学意义(P<0.01),B、C、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。A、B、C、D、E组小腿三头肌收缩力恢复率分别为87.0%±9.7%、70.0%±6.6%、69.0%±6.7%、65.0%±9.8%和45.0%±12.1%,A、B、C、D组与E组比较差异有统计学意义(P<0.05)。各组远端吻合口神经坚牢蓝染色显示神经纤维排列整齐,无炎性反应。甲苯胺蓝染色和透射电镜观察显示,B、C、D组有髓神经纤维计数及有髓神经纤维髓鞘厚度均大于E组,差异均有统计学意义(P<0.01);B组轴突直径大于C、D组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CEANA补充dADSC修复周围神经缺损与补
- 赵喆赵斌王玉彭江张莉陈继凤赵庆任志午刘炎许文静卢世璧
- 关键词：化学去细胞异体神经雪旺细胞BMSCS脂肪来源干细胞
- 激素性股骨头坏死模型骨髓间充质干细胞的生物学特性评估被引量：10
- 2012年
- 目的评估激素性股骨头坏死模型自体骨髓间充质干细胞增值能力及定向诱导能力。方法建立SD大鼠激素性股骨头坏死动物模型,行病理检查,验证模型。取模型组和对照组的骨髓间充质干细胞进行细胞生物学特性评估。结果联合运用牛血清和激素能够较好地建立激素性鼠股骨头缺血性坏死动物模型,激素性股骨头坏死SD大鼠的骨髓间充质干细胞,增值速率显著慢于对照组(P<0.05),其骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导后ALP染色阳性,但茜素红染色显示钙结节数量少于对照组,向成脂细胞定向诱后油红O染色示脂肪细胞少于对照组。结论实验组骨髓间充质干细胞仍具备干细胞的生物学特性,但相对于对照组其增殖能力减弱,成骨、成脂潜能减弱。
- 李志锐王玉陈继凤赵斌彭江张莉卢世璧董纪元
- 关键词：激素股骨头坏死骨髓间充质干细胞
- 人脐带Wharton胶间充质干细胞的生物学特性及雪旺细胞分化研究被引量：1
- 2010年
- [目的]研究人脐带Wharton胶间充质干细胞(WJMSCs)的生物学特性及向雪旺细胞诱导分化的可能性,为神经组织工程提供新的种子细胞。[方法]去除新鲜人脐带动、静脉和脐带外膜组织,获得Wharton胶,采用组织块培养法获得脐带Wharton胶中的干细胞,免疫荧光鉴定WJMSCs的细胞表面特异标记CD44,CD105,CD34,CD45,Stro-1,Vimentin和Nestin,评价干细胞的生物学特性;采用b-FGF和Forskolin等诱导WJMSCs向雪旺细胞分化,光镜观察诱导后细胞形态的变化;免疫荧光染色鉴定雪旺细胞特异性标记物p75和GFAP的表达;Western分析诱导前后雪旺细胞特异性标记物GFAP的表达。[结果]分离培养的WJMSCs免疫荧光染色CD44、CD105、Stro-1和Vi-mentin表达阳性,而CD34、CD45和Nestin表达阴性,具有间充质干细胞的生物学特性;WJMSCs经过胶质细胞生长因子的作用,光镜下发现诱导的细胞形态与雪旺细胞相似;免疫荧光染色p75和GFAP阳性;Western结果显示诱导的雪旺细胞标记物GFAP表达阳性。[结论]人脐带Wharton胶间充质干细胞可诱导分化成为雪旺样细胞,其表型和分子特征与雪旺细胞相似,诱导分化的人脐带Wharton胶间充质干细胞是一种理想的神经组织工程的种子细胞。
- 王玉张莉彭江赵斌陈继凤赵喆许文静卢世璧
- 关键词：脐带间充质干细胞雪旺细胞
- 双向差速法制备高纯度雪旺细胞的实验研究被引量：5
- 2011年
- [目的]利用乳鼠的雪旺细胞与成纤维细胞贴壁及复合酶消化分离速度不同的特点,建立简单而快速提取和纯化雪旺细胞的方法。[方法]取3 d SD大鼠双侧坐骨神经,在解剖镜下剥离去除神经外膜,剪碎后用0.2%复合胶原酶(Collagenase NB4)消化,细胞悬液接种于预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶差速贴壁30 min,然后将细胞悬液移入一新的培养瓶培养48 h;用0.05%复合胶原酶37℃消化30 min,振荡分离雪旺细胞与成纤维细胞,培养48 h后在相差显微镜下观察细胞形态;计数、纯度测定;免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测所得的雪旺细胞的纯度。[结果]经过2次纯化后,每25 cm2培养瓶可获取约(117.2±3.4)×104个细胞;第一轮纯化后雪旺细胞纯度达86.99%±1.53%,经2次纯化后纯度为98.32%±0.12%,两轮纯化之间有显著性差异,P<0.001;P75NTR免疫细胞化学鉴定细胞为阳性,流式细胞仪检测雪旺细胞纯度达97.9%。[结论]双向差速复合胶原酶消化法是一种高效、快捷的雪旺细胞纯化方法。
- 刘炎张莉宫旭陈继凤王玉赵斌任志午詹胜峰许文静彭江卢世璧
- 关键词：雪旺细胞纯化差速贴壁法周围神经再生
