- 一种定点突变的甘露聚糖酶及其应用
- 本发明公开了一种定点突变的甘露聚糖酶。它是由氨基酸序列为SEQ IDNO.1的来源于Armillariella tabescens的β‑甘露聚糖酶MAN47中制造多个氨基酸取代而产生的突变体，所述的氨基酸取代包括第197...
- 姚冬生虞晓丹吕晓慧胡凤娟谢春芳刘大岭
- 文献传递
- 基于易错PCR的假密环菌Armillariella tabescens MAN47 β-甘露聚糖酶耐高温定向进化被引量：6
- 2009年
- 本研究利用易错PCR技术突变假密环菌Armillariella tabescens MAN47 β-甘露聚糖酶野生型基因,PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体pYCα上连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后电转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,构建了库容为104的初级突变体库,筛选得到耐高温最佳突变株M262。DNS法测得80oC处理30min后最大酶活力为25U/mL,较之野生型最适条件酶活力提高了4.3倍。序列分析表明,突变体有3个碱基发生了突变:T343A/C827T/T1139C,相应的氨基酸改变为Ser115Thr/Thr276Met/Val380Ala,利用SWISS-MODEL数据库同源建模显示,这3个突变氨基酸分别位于第4个β折叠的第6个氨基酸、第6个α螺旋的第1个氨基酸、第10个α螺旋和第11个β折叠之间的转角。
- 吕晓慧胡亚冬胡凤娟刘大岭姚冬生
- 关键词：定向进化Β-甘露聚糖酶易错PCR热稳定性
- 具蛋白酶抗性的Armillariella tabescens β-甘露聚糖酶MAN47的分子定向改造被引量：6
- 2011年
- 利用定点突变的方法提高Armillariella tabescensβ-甘露聚糖酶MAN47的胰蛋白酶抗性。首先根据其氨基酸序列,找到胰蛋白酶的水解位点—赖氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg,R),再利用生物信息学软件获得酶分子结构中K和R与周围溶剂的接触程度,选定暴露程度最大的K280为候选突变位点,进行模拟突变,并分析突变前后的氢键键长和整体结构的变化。根据氢键键长的变化,确定突变体为K280N。对K280N设计突变引物,用重叠延伸PCR技术对MAN47野生型man基因进行突变,PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体PYCα连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,经人工肠液(pH 6.8 10mg/ml胰蛋白酶溶液)筛选,得到抗胰蛋白酶的最佳突变株。结果表明突变酶在用人工肠液处理180min后,其半衰期为173min,而野生型酶为99min,其他酶学性质与野生型酶基本一致。
- 胡凤娟王旭曼刘大岭姚冬生
- 关键词：定点突变Β-甘露聚糖酶重叠延伸PCR同源建模分子计算
