林旭瑷
- 作品数：37 被引量：60H指数：4
- 供职机构：浙江大学医学院病原生物学系更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金浙江省自然科学基金中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学更多>>
- 利用研磨法从凝胶中纯化小片段DNA的方法和用途
- 本发明公开了一种利用匀浆器研磨凝胶快速高效纯化回收小片段DNA的方法。将包含目的小片段DNA的凝胶在TE缓冲液中直接用匀浆器研磨后，离心收集上清，在盐离子和无水乙醇的作用下沉淀DNA，再将沉淀的DNA重溶于TE缓冲液中，...
- 林旭瑷陈寅严杰
- 文献传递
- 利用研磨法从凝胶中纯化小片段DNA的方法和用途
- 本发明公开了一种利用匀浆器研磨凝胶快速高效纯化回收小片段DNA的方法。将包含目的小片段DNA的凝胶在TE缓冲液中直接用匀浆器研磨后，离心收集上清，在盐离子和无水乙醇的作用下沉淀DNA，再将沉淀的DNA重溶于TE缓冲液中，...
- 林旭瑷陈寅严杰
- 文献传递
- 钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性作用的研究被引量：1
- 2012年
- 目的了解钩端螺旋体毒素一抗毒素系统中毒性蛋白VapC的功能及其对宿主细胞的毒性作用。方法以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板，采用PCR扩增全长vapB、vapC、vapBC基因并构建其原核表达系统。采用SDS—PAGE检测目的重组蛋白rYapB和rVapC表达情况，Ni-NTA亲和层析柱提纯rVapB和rVapC。检测rVapB和rVapC有无水解问号钩体赖株及THP．1细胞DNA或RNA活性。分别采用实时荧光定量PCR和Westernblot试验，检测问号钩体赖株感染THP．1细胞前后vapB和vapC基因转录及表达水平的变化。构建vapB和vapC基因真核表达载体并转染细胞，采用CCK-8试剂检测VapB和VapC蛋白对细胞活性的影响。结果所克隆的vapB和vapC基因核苷酸及氨基酸序列与文献报道完全相同。所构建的原核表达系统能分别表达rVapB和rVapC。rVapC可水解RNA，但不水解DNA。问号钩体赖株感染THP-1细胞后，vapB和vapC基因转录及表达水平均显著上调，部分毒性蛋白VapC外分泌。转染vapC基因的人肾小管上皮细胞HEK293大量死亡。结论问号钩体赖株VapC蛋白为RNA酶，可在感染宿主细胞过程中外分泌并对细胞有明显毒性。
- 辛晓阳林旭瑷李立伟严杰
- 关键词：致病性钩端螺旋体毒素-抗毒素系统细胞毒性
- 钩端螺旋体溶血素Sph2通过提高胞内ROS和线粒体膜损伤诱导细胞凋亡
- 林旭瑷丁士标车荣波义玉思张琴超严杰
- 人单核-巨噬细胞和中性粒细胞杀灭问号钩端螺旋体能力差异及其机制被引量：2
- 2017年
- 目的 了解人单核-巨噬细胞和中性粒细胞杀灭问号钩端螺旋体（简称钩体）能力差异及其机制.方法 人THP-1单核细胞和HL-60细胞分别用佛波酯（PMA）和全反式维甲酸（ATRA）预处理,使其分化为单核-巨噬细胞和中性粒细胞.采用激光共聚焦显微镜法检测问号钩体黄疸出血群赖型赖株感染THP-1单核-巨噬细胞和HL-60中性粒细胞内总活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）水平和游离钙离子浓度（[Ca2＋]i）变化.采用荧光分光光度法检测总ROS、NO抑制剂和胞内游离Ca2＋螯合剂（NAC、SMT和BAPTA/AM）作用前后THP-1单核-巨噬细胞和HL-60中性粒细胞杀灭胞内问号钩体的能力及其差异.结果 THP-1单核-巨噬细胞和HL-60中性粒细胞感染问号钩体后总ROS、NO水平和[Ca2＋]i均显著升高（P〈0.05）,但前者总ROS、NO水平和[Ca2＋]i显著高于后者（P〈0.05）.THP-1单核-巨噬细胞杀灭胞内问号钩体能力显著强于HL-60中性粒细胞（P〈0.05）.抑制胞内总ROS、NO和游离Ca2＋可导致THP-1单核-巨噬细胞杀灭胞内问号钩体能力显著下降（P〈0.05）,但对HL-60中性粒细胞无明显影响.结论 单核-巨噬细胞而非中性粒细胞是感染时清除问号钩体的主要吞噬细胞,高水平总ROS、NO和胞内游离Ca2＋与单核-巨噬细胞杀灭问号钩体能力密切相关.
- 阮萍林旭瑷张颖颖周海丽严杰陈旭
- 关键词：问号钩端螺旋体单核-巨噬细胞INTRACELLULARCA2+
- 问号钩端螺旋体磷脂酶C鉴定及其诱导巨噬细胞凋亡机制
- 2013年
- 目的：确定问号钩端螺旋体（简称钩体） LB361基因产物磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C （ phosphatidylinositol phospholipase C ，L-PI-PLC）功能及其诱导巨噬细胞凋亡的作用与机制。方法采用生物信息学技术分析问号钩体赖型赖株LB361基因序列中PI-PLC结构功能域。采用原核表达系统表达该基因产物（ rL-PI-PLC）。采用IP3荧光偏振试验了解rL-PI-PLC水解PIP2底物产生IP3的活性。采用实时荧光定量RT-PCR及Western blot法分别检测问号钩体赖株感染人THP-1巨噬细胞时LB361基因转录、表达及分泌情况。构建LB361基因转染THP-1细胞株，分别采用激光共聚焦显微镜法和流式细胞术，检测LB361基因产物THP-1通过IP3引起内质网钙释放，从而导致细胞胞内游离钙离子浓度（[ Ca2＋] i）升高并诱导细胞凋亡的作用。结果 rL-PI-PLC能水解PIP2产生IP3，其Km和Kcat值分别为199μmol/L和8．566×10-5 S-1。问号钩体赖株感染THP-1细胞后，LB361-mRNA及L-PI-PLC蛋白表达水平显著升高并外分泌。与未转染正常细胞比较，LB361基因转染THP -1细胞中IP3浓度及[ Ca2＋] i明显升高，从而引起部分 THP-1细胞发生[ Ca2＋] i 依赖性凋亡。结论问号钩体LB361基因产物是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，该酶在问号钩体感染巨噬细胞过程中可引起[ Ca2＋] i升高而导致细胞凋亡。
- 张金良赵金方楼宏强林旭瑷严杰孙爱华
- 关键词：问号钩端螺旋体巨噬细胞
- 一种钩端螺旋体的检测方法
- 本发明公开了一种钩端螺旋体的检测方法。即基于核酸等温扩增定量检测技术。本发明通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，在一系列质控和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对钩端螺旋体进行检测，可实现对微量...
- 林旭瑷陈寅卢亦愚严菊英严杰
- 文献传递
- 问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白OmpL1和LipL21抗原表位预测及鉴定被引量：2
- 2008年
- 目的筛选问号钩端螺旋体（简称钩体）属特异性外膜蛋白OmpL1和LipL21有效T和B细胞联合抗原表位，为研制多抗原肽（multiple antigenic peptide，MAP）疫苗提供基础。方法采用生物信息学方法预测OmpL1和LipL21分子中T和B细胞联合抗原表位。采用PCR扩增候选联合抗原表位片段并分别构建其噬菌体展示系统。分别以rOmpL1或rLipL21、黄疸出血群赖株、钩体患者抗血清为一抗，采用Western blot检测各抗血清与目的表位的免疫反应性及其强度。结果通过抗原表位预测，选择了高分值的4个OmpL1和2个LipL21联合表位。经扩增获得了预期的各抗原表位片段，各目的表位序列均准确插入噬菌体PⅢ蛋白N端并有效表达。各抗血清均能识别上述6个联合表位。其中LipL21的97-112和176-184表位对任-抗血清均显示相似强度的杂交条带。综合4个OmpL1表位对3种抗血清的不同Western blot结果及其实际意义，杂交信号从强到弱依次为173-191、87-98、297-320和59-78表位。结论所研究的6个联合表位均分别为LipL21和OmpL1的有效抗原表位，其中LipL21的97-112、176-184和OmpL1的87-98、173-191表位可应用于钩体MAP疫苗研制。
- 林旭瑷潘建平罗依惠毛亚飞李立伟严杰
- 红花注射液对野百合碱损伤血管内皮细胞NO活性、内皮型NO合成酶及结缔组织生长因子表达的影响被引量：2
- 2019年
- 目的探讨红花注射液对野百合碱(MCT)损伤的血管内皮细胞一氧化氮(NO)产生、内皮型NO合成酶(e NOS及结缔组织生长因子(CTGF)表达及活性的影响。方法人血管内皮细胞(HUVECs)分为空白对照组、MCT组、红花注射液组。以CCK-8法检测红花注射液对HUVECs增殖的抑制作用,硝酸还原酶法检测NO含量,荧光定量PCR和Western blot法检测e NOS和CTGF的mRNA和蛋白表达情况。结果红花注射液有效抑制HUVECs增殖,呈浓度依赖性。与空白对照组相比,MCT组e NOS表达降低,NO生成降低(均P<0.05),而CTGF表达增加(P<0.05);与MCT组比较,红花注射液组e NOS活性及NO的生成均增加(均P<0.05),而CTGF表达降低(P<0.05)。结论红花注射液可促进MCT损伤的血管内皮细胞e NOS活性增加及NO产生,抑制CTGF的表达和分泌。
- 陈爱凤丁士标林旭瑷孔亮亮徐俭朴
- 关键词：红花注射液野百合碱一氧化氮内皮型一氧化氮合成酶
- 环介导的等温扩增与实时荧光PCR检测问号钩端螺旋体的比较
- 2011年
- 目的通过比较环介导的等温扩增技术（loop—mediatedisothermalamplification，LAMP）与实时荧光PCR（real．timePCR）技术在检测问号钩端螺旋体的特异性及灵敏度方面的差异，寻找一种快速、灵敏且特异性强的问号钩端螺旋体检测方法。方法根据问号钩端螺旋体liplAl基因序列设计LAMP及实时荧光PCR扩增所用的特异性引物，对我国15群15株问号钩端螺旋体参考菌株进行检测，比较二者在检测的特异性和灵敏度方面的差异。结果LAMP反应大约可在30min内完成，整个分析过程不超过1h。Real-timePCR的整个过程大约需要60min。二者具有相同的检测灵敏度和特异性，最低检出限度均为100个拷贝，整个检测过程没有出现假阳性。结论在检测速度、灵敏度和特异性方面，LAMP技术与real—timePCR技术相当，但LAMP检测技术是在恒温条件下进行，不需要特别昂贵的仪器设备，检测方法简单，在基层实验室及现场检测方面具有明显的优势，是可应用于问号钩端螺旋体检测的一种有效技术。
- 方葆丁士标严杰林旭瑷
- 关键词：问号钩端螺旋体REAL-TIMEPCR
