李晓娇
- 作品数：2 被引量：5H指数：1
- 供职机构：南方医科大学附属奉贤医院更多>>
- 发文基金：上海市自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人EZH2基因编码区及3'非翻译区融合蛋白重组慢病毒表达载体构建及其在293T细胞中的表达被引量：4
- 2012年
- 目的构建携带人EZH2基因编码区(coding region,CDS)及3'非翻译区(3'untranslated region,3'UTR)融合红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)重组慢病毒表达载体,使mCherry-EZH2融合蛋白在293T细胞中稳定表达。方法运用In-Fusion定向克隆技术构建人EZH2基因CDS区及3'UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体,测序无误后抽提质粒,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。Western blot检测mCherry-EZH2的表达。结果测序证实重组慢病毒表达载体基因序列完全正确;病毒颗粒包装成功,滴度为1.59×109IU/ml;Western blot检测293T细胞中可以表达mCherry-EZH2融合蛋白。结论成功构建人EZH2基因CDS区及3'UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体及病毒,其mCherry-EZH2可以在293T细胞中稳定表达。为进一步分析可能调控EZH2基因CDS区及3'UTR表达的miRNA奠定前期实验基础。
- 彭攸赵卫卫李晓娇王玉平卢晓佳邬美玉冯景
- 关键词：EZH2基因红色荧光蛋白
- EZH2基因3'非翻译区慢病毒载体构建及重组体筛选被引量：1
- 2013年
- 目的构建携带人EZH2基因3'非翻译区(3'UTR)的慢病毒筛选载体并实现该重组体在人乳腺癌MCF-7中稳定整合,为下一步MicroRNAs(miRNAs)筛选奠定基础。方法从组织中提取并用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出EZH2基因3'UTR,构建携带EZH2基因3'UTR的重组慢病毒载体CTX-Lentivirus-EZH2 3'UTR,脂质体法将重组的慢病毒载体和包装载体混合物共转染工具细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒。用裂解液裂解病毒颗粒,根据慢病毒载体上的CMV启动子表达量检测病毒滴度。用慢病毒颗粒感染乳腺癌MCF-7细胞后,通过嘌呤霉素筛选稳定整合的乳腺癌细胞MCF-7,用Real-Time PCR和Western blotting方法检测EZH2基因3'UTR是否整合入细胞MCF-7中。结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序结果证实,EZH2基因3'UTR成功定向克隆到慢病毒载体上。Real-Time PCR检测病毒滴度为4.3×109拷贝/mL。筛选稳定整合MCF-7细胞的最佳浓度为0.2μg/mL。重组慢病毒转导MCF-7后,Real-Time PCR和Western blotting方法分别检测EZH2基因3'UTR整合到乳腺癌细胞MCF-7基因组中。慢病毒感染实验组和对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建携带EZH2基因3'UTR慢病毒筛选载体,实现重组体在乳腺癌MCF-7细胞中稳定整合。
- 赵卫卫彭攸李晓娇卢晓佳王玉平刘萃萃王璐璐冯景
- 关键词：EZH2非翻译区慢病毒载体MCF-7
