范开
- 作品数：30 被引量：69H指数：5
- 供职机构：重庆理工大学药学与生物工程学院更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项重庆市自然科学基金“重大新药创制”科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 重组人β干扰素-1b的融合表达及制备被引量：1
- 2010年
- 通过融合表达获得无需复性的重组人β干扰素-1b(17Ser-β-IFN)。运用PCR方法扩增带有EK(肠激酶)蛋白酶酶切位点的人β干扰素-1b基因,构建重组表达载体pET32-a-EK-β-IFN-1b,通过工程菌(pET32-a-EK-β-IFN-1b/Qrigami DE3)表达融合蛋白TRX-β-IFN-1b。经纯化的融合蛋白,在一定的酶切条件下用EK酶酶切后,通过反相C18柱纯化获得高纯度的重组人β-IFN-1b,再经细胞病变抑制法测定其抗病毒比活性。结果表明,TRX-β-IFN-1b融合蛋白表达量达到菌体总蛋白的30%以上,EK酶酶切效率不低于90%。制备的重组人β-IFN-1b的质谱分子量与理论值一致,抗病毒活性比国内外报道的相同蛋白高出2倍以上,达到4.5×107IU/mg。通过融合表达制备的重组人β-IFN-1b具有治疗多发性硬化症或肝炎的临床价值。
- 刘日勇罗岚范开
- 关键词：Β干扰素肠激酶抗病毒活性
- 重组人睫状神经因子的表达、纯化以及聚乙二醇修饰被引量：2
- 2009年
- 目的研究重组人睫状神经因子(rh-CNTF)的表达、纯化及聚乙二醇化修饰、纯化方法。方法重组人睫状神经因子(rh-CNTF)工程菌经37℃培养至对数生长期,加入IPTG诱导4h,经QSepharose F.F凝胶柱纯化和复性后得到纯化的rh-CNTF。以体外培养鸡胚背根神经节(DRG)方法测定重组蛋白rh-CNTF的神经营养活性。用单甲氧基聚乙二醇丁醛(mPEG-ButyrALD-20k)对rh-CNTF进行修饰,所得修饰产物经DEAESepharose F.F和Superdex 75凝胶分离纯化后获得mPEG-rh-CNTF偶联物。结果目的蛋白占总蛋白30%左右,为包涵体,经QSepharose F.F凝胶柱纯化和复性,获得纯度达90%的rh-CNTF。表达的rh-CNTF能促进培养的鸡胚背根神经节神经突起的生长。修饰后的单聚PEG-rhCNTF经DEAESepharose F.F和Superdex 75凝胶纯化后纯度达到95%。结论确立了rh-CNTF蛋白表达纯化及PEG修饰的方法。
- 王彦范开夏永鹏张继兰梅翔陈海容李秀梅邱宗荫
- 关键词：纯化聚乙二醇修饰
- 抓核心课程教学改革 提高本科生培养质量
- 2010年
- 讨论在部分生化类专业核心理论课程的"能力培养型"教学中,围绕培养和提高学生的主动学习能力和创新思维能力这一目标,提高理论课程教学效果,进而带动本科生培养质量的提高。采用多种不同教学技巧的组合及其在不同生化类专业核心理论课程教学中的连续应用,可以较好地改进课程教学效果和学生的主动学习能力,有助于培养学生的创新思维和创新能力。
- 周跃钢范开王万能
- 关键词：核心课程生物化学基因工程
- 含短C肽人胰岛素原类似物DesB^30在毕赤酵母中的表达及纯化被引量：7
- 2008年
- 合成含短C肽AAK,并去掉B链第30位苏氨酸(T)的人胰岛素原类似物:HMPIDesB30(human mini-proinsulin des B30)的cDNA,将其插入大肠杆菌和酵母菌的穿梭质粒pPIC9K.用电转移的方法将重组质粒HMPIDesB30/pPIC9K转入甲醇酵母GS115.用含不同G418浓度的YPD平板筛选高拷贝重组子.经优化条件下的高密度发酵,发酵液用SIPI-40大孔树脂吸附,大孔吸附树脂洗脱液经SP柱进一步纯化后,再用10～20mmol/L Zn2+沉淀,能得到纯度为95%的HMPIDesB30.通过16.5%Tricine SDS-PAGE、HPLC和质谱分析,表达产物分子质量与理论分子质量相符,经高密度发酵,表达量可达1.0g/L.纯化回收率可达60%.说明人胰岛素原类似物HMPIDesB30能在甲醇酵母中高效分泌表达,并能通过经济有效的方法纯化.
- 高剑坤蔡绍皙范开冯强陈海蓉张益胡伟杨应彬
- 关键词：人胰岛素原甲醇酵母
- 重组可逆转水蛭素制备及活性测定
- 2012年
- 将重组可逆转水蛭素(G4-HV1)的cDNA序列插入工程质粒pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-G4-HV1,并电转至毕赤酵母GS115;然后进行高表达筛选,表达后的菌液经离心、纯化得到了纯度95%以上的G4-HV1;最后通过生色底物法测定G4-HV1抗凝活性约为14 000ATU。与凝血酶结合的动力学实验表明,G4-HV1可被凝血酶逆转,可逆转率为30%～40%。
- 黄程李红亮冯一建陈勇陈海容王林范开
- 关键词：水蛭素可逆转活性
- 大肠杆菌中可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子21及制备被引量：1
- 2011年
- 为在大肠杆菌中高效、非融合、可溶性表达重组人成纤维细胞生长因子21(rhFGF-21),研究了纯化方法,以获得具有较高生物活性的rhFGF-21。全基因合成人成纤维细胞生长因子21cDNA序列,克隆进原核表达载体pET-3c,在转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中进行表达。表达产物经盐析、层析等方法纯化后,利用3T3-L1细胞鉴定其促葡萄糖摄取的生物学活性。结果表明:rhFGF-21在BL21(DE3)PlysS实现了高效、非融合、可溶性表达,目的蛋白占菌体总蛋白的20%左右;表达产物经纯化后,纯度可达95%以上;表达产物能够明显促进3T3-L1细胞对葡萄糖的吸收。该方法成功实现了rhFGF-21在大肠杆菌中高效可溶性表达。
- 范开谭克海张淳张益
- 关键词：可溶性表达葡萄糖摄取
- 聚乙二醇化重组集成α干扰素在食蟹猴长期毒性中结合抗体和中和抗体的活性
- 2010年
- 研究了食蟹猴皮下注射聚乙二醇化重组集成α干扰素(代号PEG-SA)低、中、高剂量(10,30,90μg/kg及对照组)1次/7 d,共180 d后血清中第15,29,43,57,71,92,113,134,162,180 d及停药后30 d的结合抗体及中和抗体滴度。结合抗体测定采用的是间接ELISA法,中和抗体测定采用的是细胞病变抑制法。结合抗体滴度以OD值大于阴性对照组OD值2.1倍为阳性。中和抗体活性的产生以保护50%细胞免受病毒侵犯为判断依据,即50%细胞病变表明产生中和抗体。结果表明,两者活性均在57 d到达高峰,停药后结合抗体和中和抗体活性减弱或消失,中高剂量组抗体活性高于同时段低剂量组活性。PEG-SA皮下注射后,可诱导食蟹猴产生结合抗体及中和抗体,二者活性具有剂量相关性。
- 范开杨华君罗岚
- 关键词：ELISA食蟹猴中和抗体
- 重组赖氨酸内肽酶构建表达及活性方法研究被引量：1
- 2015年
- 设计了重组赖氨酸内肽酶蛋白氨基酸序列,根据P.Pastoris酵母密码子偏爱性原则设计c DNA序列,其中TGA和TAA为两个终止密码子序列,并在序列5’端和3’端分别设计Xho I(CTCGAG)和Not I(GCGGCCGC)限制性酶切位点,将其重组到原核表达质粒p MD19-T中,得到p MD19-T-Lys-C,并在毕赤酵母中获得表达。应用SDS-PAGE电泳及免疫斑点法检测其表达,RP-HPLC分析重组赖氨酸内肽酶可以特异性切除赖氨酸基团C末端的氨基酸残基,证明该重组的赖氨酸内肽酶可替代Lysyl Endopeptidase应用于胰岛素的制备工艺中。
- 马妍付志成范开
- 关键词：基因重组胰岛素原活性
- 短C肽门冬胰岛素制备工艺的研究
- 2015年
- 为研究门冬胰岛素制备工艺,参照毕赤酵母偏好密码子,设计合成N-端连接引导肽EEAEAEAEPK,以KEWK作为短C肽,A、B链结构完整的门冬胰岛素c DNA序列。利用Xho I-Not I酶切位点将其插入表达质粒p PICZαA,采用电转移方法将重组质粒转入毕赤酵母x-33,筛选高拷贝重组子作为工程菌株进行高密度发酵,表达量可达到0.57 g/L。发酵液经金属螯合层析和SP阳离子层析纯化后鉴定正确。建立CPB/Trypsin双酶切工艺,对不同温度及p H条件下产生的酶切产物进行分析,初步建立了酶切最佳p H值和温度条件。酶切产物经纯化后制得纯度为91.7%的门冬胰岛素,副产物为B链30位缺失的门冬胰岛素。该设计方法为含短C肽EWK门冬胰岛素制备中选用Lys-c酶切成本过高的问题提供了备选解决方案。
- 付志成马妍张增涛刘日勇何勇范开
- 关键词：门冬胰岛素毕赤酵母纯化
- IGF-1基因产物的结构和功能多样化被引量：6
- 2008年
- 胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因包含6个外显子,具有转录和翻译产物多样化的特点,原因在于存在多个转录起始位点的选择性应用,转录产物的选择性剪接,以及不同多聚腺苷酸化位点的使用。长期以来人们普遍关注由外显子3和4编码的循环型IGF-1在生长发育中的作用,最近对肌肉、神经等组织自分泌/旁分泌的局部型IGF-1研究发现,选择性剪接产生的IGF-1变体具有外显子5和6编码的延伸肽(E肽),并表现出特殊的生物学功能,如IGF-1Ea、IGF-1Eb(MGF)及其E肽在骨骼肌、心肌、神经等组织中表现出促进生长和损伤修复的功能,这些特殊功能可能通过细胞表面的一种特殊E肽受体介导。
- 张兵兵王远亮范开
- 关键词：胰岛素样生长因子-1选择性剪接
