李陶敬
- 作品数：10 被引量：49H指数：3
- 供职机构：武汉生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国际科技合作与交流专项项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学理学更多>>
- 检测人凝血因子Ⅷ蛋白质含量的BCA法的优化及验证被引量：20
- 2013年
- 目的优化检测人凝血因子Ⅷ(FⅧ)蛋白质含量的BCA法,并进行验证。方法对BCA法检测人FⅧ的蛋白质含量进行优化:模拟试管法进行化学反应,微量板法进行读数和计算;对优化后的BCA法的耐用性、标准曲线的线性和范围、准确性、重复性、中间精密性进行验证,并与传统的钨酸沉淀法、免疫散射比浊法和优化的凯氏定氮法的检测结果进行比较。结果 BCA法检测人血白蛋白(human serum albumin,HSA)蛋白质含量的可信区间为100～800μg/ml。甘氨酸和赖氨酸的浓度小于125 mmol/L时,对BCA法检测结果无干扰;以HSA作为标准品绘制的标准曲线的可信区间为62.5～1 000μg/ml,人FⅧ工艺样品在以HAS和BSA作为标准品绘制的两种标准曲线下的检测值差异无统计学意义(P>0.05);BCA法的准确性、重复性、中间精密性均符合验证要求;BCA法检测结果与优化后的凯氏定氮法相关性良好。结论优化了检测人FⅧ蛋白质含量的BCA方法,该法用于人FⅧ生产工艺中间品的质量控制是可行的。
- 周志军李策生李陶敬林连珍彭焱吴凡邹炜
- 关键词：蛋白质含量凯氏定氮法
- 人凝血因子Ⅷ中试纯化工艺的质量控制被引量：13
- 2013年
- 目的对以PEG沉淀结合离子交换层析制备的人凝血因子Ⅷ(human coagulation factorⅧ,FⅧ)的中试纯化工艺进行全程质量控制。方法收集FⅧ中试纯化工艺的样品,采用凝固法检测FⅧ凝固活性、BCA法检测总蛋白含量,计算比活性;采用免疫浊度法检测白蛋白(albumin,ALB)、IgG、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)及纤维连接蛋白(fibronectin,FNC)含量;采用双抗体夹心ELISA法检测FⅧ及von Willebrand因子(von Willebrand factor,vWF)抗原含量;采用SDS-PAGE及Western blot法分析FⅧ特异性;参考《中国药典》(三部)2010版检测成品中PEG、Tween 80及磷酸三丁酯[tr(in-butyl)phosphate,TNBP]残留量。结果层析去掉了大部分杂蛋白,层析后比活性提高了近20倍,原液比活性达到66.92 IU/mg。PEG沉淀和DEAE层析纯化,基本去除了ALB、IgG、FIB和FNC,仅有少量FⅧ抗原及活性损失,原液主要成分为FⅧ和vWF。DEAE层析洗脱峰样品在相对分子质量约95 000和72 000之间可见一条特异性条带,与FⅧ轻链(相对分子质量80 000)及冻干FⅧ国家标准品条带位置相符。PEG、Tween 80及TNBP残留量均符合《中国药典》(三部)2010版规定的FⅧ质量标准。结论本中试纯化工艺可制备出高纯度、高比活性的FⅧ。
- 李策生周志军胡勇邢延涛李陶敬林连珍彭焱邹光荣
- 关键词：凝血因子纯化
- 不同配方的冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ制品干热法灭活猪细小病毒效果的影响被引量：2
- 2013年
- 目的研究不同配方的冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ制品干热法灭活非脂包膜指示病毒猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)效果的影响。方法取人凝血因子Ⅷ原液,分别加入A、B、C 3种配方(氯化钠浓度为C6 LgTCID50/ml的指示病毒PPV,进行冻干、干热法灭活(100℃30 min),检测残余PPV滴度;用筛选出的最佳配方制备3批人凝血因子Ⅷ半成品,进行冻干和干热法灭活,检测残余PPV滴度,验证PPV灭活效果;按照《中国药典》三部(2010版)人凝血因子Ⅷ的成品检测要求对人凝血因子Ⅷ效价、外观、水分、复溶时间和复溶后外观进行检测。结果在100℃30 min条件下,可有效灭活配方A制备的人凝血因子Ⅷ半成品中的指示病毒PPV,确定配方A为最佳冻干保护剂配方;3批凝血因子Ⅷ经干热灭活后,可使残余PPV滴度下降(4.08±0.02)LgTCID50/0.1 ml,且灭活过程对人凝血因子Ⅷ的生物学活性无明显影响,步骤活性回收率为(91.1±2)%。结论已成功研制出1种冻干保护剂配方,应用干热灭活法对人凝血因子Ⅷ制品中非脂包膜病毒PPV具有较好的灭活效果,该方法与有机溶剂/表面活性剂(solvent/detergent,S/D)法联合去除/灭活病毒,可有效提高人凝血因子Ⅷ产品的安全性。
- 李策生邹莉李陶敬胡勇邢延涛彭焱周雁翔李娟
- 关键词：冷冻干燥猪细小病毒灭活
- 层析法从血浆分离静注人免疫球蛋白及其初步检定被引量：3
- 2013年
- 目的实验尝试采用多步柱层析的工艺取代乙醇低温沉淀的方法,能高效的从血浆中获得IVIG产品。方法通过亲和层析、离子交换一套工艺纯化出IVIG产品,进而按照《中华人民共和国药典》对静注人免疫球蛋白(pH4)及其关键指标进行了检测。在此基础上还采用免疫浊度法等方法,对其纯度和非目的蛋白构成与国际产品进行比较。结果工艺获得IVIG产品的关键性指标检测均达到《中华人民共和国药典》的要求,其质量不低于现有国际同类产品。结论本工艺能以较高回收率获得高质量的IVIG产品。
- 邹炜李策生周志军李陶敬胡勇邢延涛高少阳
- 关键词：静注人免疫球蛋白离子交换层析
- 人纤溶酶活性动态显色检测方法的建立及验证被引量：3
- 2017年
- 目的建立人纤溶酶(plasmin,Plm)活性的动态显色检测方法,并进行验证。方法用微量滴定板作为载体,将不同活性浓度的Plm(1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 IU/ml)分别与不同浓度的发色底物S-2251(2.0、1.0、0.66、0.33 mg/ml)混匀,连续监测10 min,测定反应体系吸光值变化率(ΔA/min),确定方法的反应参数。同时对方法的选择性、线性范围、定量下限、准确度、精密性、特异性及稳定性进行验证。采用建立的方法检测Plm纯化样品。结果确定定量上限为0.6 IU/ml,底物浓度为0.66 mg/ml;监测5 min时校正标样及质控样品回收率为92.0%~111.8%,定量下限样品回收率为96.5%~118.0%。注射用水、稀释液、尿激酶(Urokinase,UK)、6-氨基己酸(6-Aminocaproic acid,EACA)、人纤溶酶原(plasminogen,Plg)等组分的响应低于定量下限响应的8.22%,并低于内标响应的0.86%,表明该方法具有良好的选择性;线性范围为0.05~0.6 IU/ml,校正标样回收率在96.8%~111.2%之间,R2≥0.99;定量下限为0.05 IU/ml,定量下限处准确度在115.2%~116.2%之间,CV≤5.0%;高、中、低浓度质控样品检测结果准确度在102.3%~111.8%之间;批内CV值≤7.7%,批间CV值≤5.2%;0.5μg/ml UK对Plm活性检测无影响,EACA浓度在0.05~0.2 mol/L之间及Plg浓度低于0.3 mg/ml时对Plm活性检测结果无影响;Plm质控样品复溶后在室温及2~8℃放置1 h不影响检测结果。Plm纯化样品活性回收率为91.84%。结论本方法具有良好的准确度、精密度、特异性及稳定性,可用于工艺样品中Plm活性的检测。
- 岳胜兰周志军彭焱林连珍李陶敬邢延涛汪菲菲李策生胡勇
- 关键词：酶活性
- S/D法及干热法对人凝血因子Ⅷ制品中猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒灭活效果的验证被引量：1
- 2016年
- 目的验证S/D法及干热法对人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品中猪伪狂犬病病毒(pesdorabies virus,PRV)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)的灭活效果。方法以PRV和PPV为指示病毒,模拟FⅧ生产工艺中的S/D及干热病毒灭活工艺,采用96孔板微量细胞病变法检测3批FⅧ半成品的残留病毒滴度。结果批号为201203002、2012-04003、201204004 3批FⅧ半成品经(25±1)℃S/D灭活处理15 min后,PRV滴度分别下降≥6.5、≥6.8、≥6.8 lg TCID50/0.1 ml;经(100±2)℃干热灭活30 min后,PPV滴度分别下降4.00、3.92、3.94 lg TCID50/0.1 ml。结论 S/D法及干热法分别对FⅧ制品中PRV和PPV具有良好的灭活效果,本实验为凝血因子类制品的病毒灭活验证工艺的研究奠定了基础。
- 邹浩勇杨禅堂李陶敬彭焱邹莉杨邦玲
- 关键词：猪伪狂犬病病毒猪细小病毒
- pH值、辛酸钠浓度和灭活时间对病毒灭活效果的影响
- 2015年
- 目的探讨p H值、辛酸钠浓度和灭活时间对辛酸钠用于人免疫球蛋白制品中加入的脂包膜指示病毒灭活效果的影响。方法向不同p H值和不同辛酸钠浓度的人免疫球蛋白制品中加入指示病毒伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）,于30℃水浴条件下作用不同时间后,采用细胞病变法测定残余病毒滴度,对不出现病变的细胞盲传3代。探讨p H值、辛酸钠浓度和灭活时间对辛酸钠灭活PRV效果的影响。结果在酸性p H值（4.6±0.2）条件下,当辛酸钠浓度在7-13 mmol/L时,均能在5 min以内灭活PRV≥7.00 Lg TCID50/0.1 ml。在中性p H值（7.4±0.2）条件下,13 mmol/L辛酸钠能瞬时灭活PRV≥7.00 Lg TCID50/0.1 ml,而7、9和11 mmol/L浓度的辛酸钠能灭活PRV 2.8、0.43和3.2 Lg TCID50/0.1 ml,均不能瞬时完全灭活病毒,但继续灭活至5 min,可灭活PRV≥7.00 Lg TCID50/0.1 ml。灭活后不出现病变的细胞盲传3代未出现细胞病变。结论辛酸钠可有效灭活加入人免疫球蛋白制品中的脂包膜指示病毒PRV;且酸性p H值条件下,辛酸钠的灭活效果优于p H值中性条件;辛酸钠对指示病毒的作用是灭活而非抑制。
- 邹莉李陶敬彭焱邢延涛
- 关键词：辛酸钠PH值伪狂犬病病毒人免疫球蛋白
- 血浆特定蛋白检测在IgG层析法中试纯化工艺中的应用被引量：6
- 2013年
- 目的通过血浆特定蛋白检测，对层析法纯化IgG的中试工艺进行质量控制。方法采用免疫散射比浊法及BNP特定蛋白分析仪及配套试剂，全面检测生产用和中试纯化工艺用原料血浆的组成，建立血浆中白蛋白（albumin，ALB）、IgG、IgA、IgM、补体3（compliment3，C3）、c4、转铁蛋白（transferin，TRF）、α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，AAT）、d2巨球蛋白（alpha2-macroglobin，A2M）、触珠蛋白（haptoglobin，HPT）、α1酸性糖蛋白（alphal-acid glycoprotein，AAG）、铜蓝蛋白（ceruloplasmin，CER）、纤维蛋白原（fibfinogen，FIB）、抗凝血酶Ⅲ（antithrombinⅢ，ATⅢ）、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 18项特定蛋白分布的数据库；对3批中试纯化工艺各步骤中ALB、IgG、IgA、IgM、FIB、AAT的去除情况及IgG回收率进行监测，验证工艺的稳定性；将3批中试纯化工艺制备的原液及成品中IgG含量的检测结果与凯氏定氮法检测结果进行比较，验证免疫散射比浊法的准确度及不同人员重复检测的中间精密度；对中试纯化工艺及低温乙醇法制备的IgG原液的杂质含量及亚类进行比较分析。结果中试纯化工艺用原料混浆中仅TRF、A2M、ATⅢ含量与生产用原料混浆差异有统计学意义（P〈0．05）；中试纯化工艺用原料血浆经A2P亲和层析去除了大部分的ALB、AAT，辛酸盐沉淀去除了剩余的ALB、FIB和IgM，DEAE离子交换纯化去除了IgA和ALB，IgG总回收率高于70％，表明该工艺稳定性好，提高了目标蛋白的得率。中试纯化工艺制备的IgG原液及成品的检测CV值均〈10％，回收率在90％-110％之间，表明该方法准确度及精密度良好；与低温乙醇法制备的IgG原液相比，中试纯化工艺制备的原液杂质含量更低，IgG的亚类分布与所用的原料血浆相似。结论血浆特定蛋白检测在血浆蛋白纯化工艺的监控和优化中具有应用价值。
- 李策生周志军胡勇李陶敬林连珍彭焱高少阳
- 关键词：血浆蛋白免疫比浊法纯化IGG
- 人凝血因子Ⅷ原液生产工艺放大可行性研究被引量：3
- 2014年
- 目的对比3批小试（50g冷沉淀）、3批小规模放大（400g冷沉淀）和3批中试级（5-10 kg冷沉淀）试验结果探讨人凝血因子Ⅷ原液生产工艺放大的可行性。方法 Tris溶液复溶冷沉淀,经聚乙二醇沉淀后,0.3%磷酸三丁酯和1%Tween 80处理6h以灭活脂包膜病毒,然后经DEAE 650M层析纯化。绝大部分杂蛋白和磷酸三丁酯及Tween80随流穿液直接流穿,洗脱峰样品即为人凝血因子Ⅷ原液。结果 3批小试人凝血因子Ⅷ活性回收率分别为30.50%、24.40%和25.60%,平均值26.83%,回收率变异系数8.52%;3批小规模放大回收率分别为19.40%、21.70%和22.00%,平均值21.04%,回收率变异系数5.54%;3批中试级回收率分别为14.50%、16.50%、17.80%,平均值16.27%,回收率变异系数8.34%。结论对比级放大试验各级回收率及变异系数发现,工艺重复性好,放大可行。
- 邢延涛李策生胡勇陈克金李陶敬周志军林连珍邹莉彭焱邓志军
- 关键词：离子交换层析
- 酶标板法检测甘油三酯净含量方法的优化、验证及其在人血白蛋白层析纯化工艺中的应用
- 2014年
- 目的优化酶标板法检测甘油三酯（triglyceride,TG）净含量的方法,进行验证,并将其应用于监测人血白蛋白层析纯化工艺中样品的脂类含量,对工艺优化提供指导。方法建立酶标板上快速检测TG含量方法,通过两步酶反应的吸光度值的差值计算TG净含量。确立该方法的标准曲线范围,并进行准确度和精密度进行验证。采用该方法监测层析工艺中样品的TG净含量,优化人血白蛋白层析纯化工艺。结果该方法检测TG的线性范围在78-2500μg/ml之间,游离甘油（free glycerin,FG）的线性范围在8.13-260μg/ml之间,R2均为0.997。各样品检测结果 CV均〈4%,回收率在102%-107%之间,准确度较好;同一样品由同一个实验员在同一试验中连续测定6次和由不同的实验员在不同日期内分别测定3次的结果,CV均〈3%,精密度较好。在人血白蛋白层析纯化工艺中采用去脂剂可将白蛋白样品中的残余脂类去除。结论优化后的甘油三酯净含量检测方法为人血白蛋白层析纯化工艺的优化提供了指导,在血液制品工艺研发过程中具有重要的应用价值。
- 周志军李陶敬邹炜胡勇李策生
- 关键词：血浆蛋白甘油三酯
