李刚锐
- 作品数：7 被引量：8H指数：1
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- 发文基金：“十一五”国家科技支撑计划国家自然科学基金四川省教育厅重点项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 黑曲霉脂肪酶的分离纯化及酶学性质的研究被引量：1
- 2014年
- 目的以黑曲霉发酵液为原料，分离纯化脂肪酶，并研究其酶学性质。方法以硫酸铵沉淀、Q—SepharoseFastFlow和SephacrylS-200凝胶层析等方法分离纯化脂肪酶，利用SDS—PAGE、PAGE、IEF—PAGE等方法进行鉴定。结果所得脂肪酶为单一条带，等电点为3．2，天然分子质量为43．7kDa。以P—NPP为底物，在pH6、50℃条件下，K。=15．67mmol·L^-1；脂肪酶对多种油脂均有水解作用；此酶在65℃以下，pH3—12稳定，在50℃、pH4表现出相对高的酶活性；Ca^2＋、Co^2＋、Mn^2＋、Ni^2＋、卵磷脂、胆酸钠对脂肪酶活性有激活作用，Hg^2＋有抑制作用；PMSF对此脂肪酶有特异性修饰作用。结论确定了黑曲霉脂肪酶的部分酶学性质，为脂肪酶的应用提供了理论依据。
- 师慧孟尧范翔李刚锐孟延发
- 关键词：黑曲霉脂肪酶分离纯化
- 天花粉蛋白的制备及其性质被引量：5
- 2014年
- 目的采用两步层析法快速制备天花粉蛋白(TCS),并验证其SOD活性。方法粉碎栝楼块茎并抽提,经硫酸铵分级沉淀,再经Blue-Sepharose CL 6B和SP-Sepharose两步层析,可获得TCS纯制剂;采用SDS-PAGE和PAGE鉴定其均一性;用MTT法检测TCS对Hela细胞的抑制作用;采用PAGE-NBT活性染色法与邻苯三酚自氧化法相结合检测了TCS的SOD活性。结果用两步层析法可获得高纯度和高收率的TCS;经SDS-PAGE和PAGE鉴定,均为单一蛋白质着色带;TCS对Hela细胞增殖具有明显抑制作用,呈时间和浓度依赖关系;TCS不具有SOD活性。结论所用TCS纯化方法简单、快速、收率高,可大量制备具有生物活性的TCS,同时也首次证明了TCS不具有SOD活性。
- 杨烨范翔李刚锐李林俐栗克喜孟延发
- 关键词：天花粉蛋白SOD活性核糖体失活蛋白栝楼
- MAP30的免疫亲和层析纯化及其表征
- 2023年
- 目的建立一种快速纯化苦瓜毒素抗艾滋病毒蛋白(MAP30)多肽的免疫亲和层析方法。方法将苦瓜毒素MAP30作为抗原,免疫新西兰大白兔(雄性),制备抗血清。采用Mabselect亲和层析法纯化多克隆抗体。以Sepharose 2B作为基质与多克隆抗体相偶联合成的抗体-Sepharose 2B亲和层析介质用于纯化苦瓜毒素MAP30。结果用自制的免疫亲和介质纯化的MAP30毒素,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),在还原条件下均显示单一蛋白着色带,对应的相对分子量均为30 kDa;酸性PAGE分离后,经高碘酸氧化法,显示糖蛋白特征;采用硫酸-蒽酮法测得总糖含量是1.54%;PC12细胞作为测试对象,MAP30抗肿瘤活性的最大抑制率为90%。结论取得的实验结果表明,纯化的目标蛋白-MAP30的结构、性质以及活性特性均与文献报道相一致,表明本文建立的免疫亲和层析方法用于分离和纯化MAP30可行。
- 强子豪周怡萍杨迪吴妍丽张永佳范翔李刚锐孟延发孟尧
- 关键词：核糖体失活蛋白多克隆抗体
- 兔肌3-磷酸甘油脱氢酶的提纯及性质研究
- 2013年
- 目的:研究兔肌3-磷酸甘油脱氢酶的分离纯化方法及其酶学性质,为测定血清甘油三酯所用酶联试剂的开发提供试验基础和理论依据。方法:通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose、Blue-Sepharose和羟磷灰石纯化兔肌3-磷酸甘油脱氢酶,利用凝胶过滤和梯度PAGE(5%～15%)法测定酶分子量,采用常规酶学动力学分析方法,考察pH、温度、底物浓度以及部分金属离子与有机化合物对酶促反应的影响。结果纯化后的兔肌3-磷酸甘油脱氢酶经PAGE(12%)分析为单一条带;酶分子量为115～122 kDa;酶最适温度45℃,最适pH 9;酸碱稳定范围pH6～9,低于45℃时热稳定性好;最适条件下,以3-磷酸甘油和NAD+为底物,测得酶的Km分别为7.4×10-3mol/L和1.47×10-4mol/L;Ba2+、Mn2+、Fe2+、Al3+、Cu2+、Ni2+、Ag+、Hg2+、NaN3、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Mg2+、Ca2+、Co2+、Zn2+有一定程度的激活作用,其中Co2+和Zn2+对酶的激活作用能达到200%以上,有机化合物NaF对酶的活性没有影响。
- 王振伟李刚锐李琳俐王帅坤孟延发
- 关键词：纯化动力学性质
- 聚乙二醇化黑曲霉脂肪酶的性质分析
- 2014年
- 目的用聚乙二醇对脂肪酶进行化学修饰,以提高酶的物化特性。方法选择20 kD(mPEG)2-Lys-NHS作为修饰剂,实验条件下与黑曲霉脂肪酶发生化学修饰反应;采用Sephacryl S-200凝胶层析法分离聚乙二醇化脂肪酶,利用SDSPAGE法测定分子量,采用常规酶学方法分析比较脂肪酶经聚乙二醇化前后的酶学动力学行为。结果经SDS-PAGE检测获得的脂肪酶为两条带:mPEG2-lipase-Ⅰ、mPEG2-lipase-Ⅱ(分子量分别约105.2、88.7 kD);修饰后脂肪酶的活性保留69%,修饰度50%。以p-NPP为底物,在pH6、50℃条件下比较修饰前后脂肪酶的酶学性质表明:lipase和mPEG2-lipase的Km值分别为21.6、24.8 mmol·L-1,最适反应温度均为50℃,mPEG2-lipase的最适反应pH5,比lipase向碱性方向移动了1个单位,修饰后热稳定性和pH稳定性有了大幅度提高;mPEG2-lipase在4℃下保留6个月,而未修饰酶的活性减少20%;修饰后脂肪酶在有机试剂中耐受性略微提高。结论研究确定了黑曲霉脂肪酶经过聚乙二醇修饰后部分酶学性质,优化了脂肪酶的物化性能,为脂肪酶在食品、化妆品、化工、医药等行业的应用提供了理论依据。
- 李林俐李刚锐范翔孟延发
- 关键词：黑曲霉脂肪酶聚乙二醇修饰酶学性质
- 溶胶凝胶法固定化黑曲霉脂肪酶的性质研究被引量：1
- 2014年
- 近年来溶胶．凝胶法固定脂肪酶已成为研究热点。选用TMOS、MTMS、ETMS和PTMS4种硅烷试剂对黑曲霉脂肪酶进行了固定化研究。固定化的最佳配方为ETMS／TMOS=5：1、水与硅烷试剂分子比为8；固定化脂肪酶的固定率为80．2％、相对活性为136．3％；以乳化橄榄油作为底物，在50℃和pH4．0的条件下，固定化脂肪酶与游离脂肪酶Km分别为1．899×10^-4 M和2．789×10^-4 M；最适反应pH均为pH4．0，固定化脂肪酶在pH4．0～pH5．5之间其活性能保持95％以上；固定化脂肪酶最适反应温度为60℃，较游离脂肪酶提高了10℃；固定化脂肪酶的酸碱稳定性和热稳定性较非固定化酶有显著的提高。固定化脂肪酶的使用寿命和保存稳定性良好，使用12次后仍能够保留71．7％活性，在室温避光条件下保存180天后仍可保留79．2％活性。
- 李刚锐李林俐范翔孟延发
- 关键词：脂肪酶溶胶-凝胶固定化黑曲霉
- 带His标签重组产朊假丝酵母尿酸酶的表达、纯化与部分酶学性质研究被引量：1
- 2018年
- 目的研究重组产朊假丝酵母尿酸酶的高效表达条件、分离纯化和部分酶学性质。方法选择在菌体对数生长末期加入诱导剂,通过摇瓶培养对异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)和乳糖诱导产酶的效果进行比较;利用50 L发酵罐研究诱导培养时间;通过Ni-琼脂糖凝胶柱亲和层析、Sephacryl S-200 HR层析纯化目的蛋白并研究其最适pH值和酸碱稳定性、最适温度及热稳定性。结果摇瓶培养结果显示乳糖诱导效果优于IPTG。发酵罐培养工程菌,在对数生长末期添加乳糖诱导7 h后酶活力和生物量均达到最大值,分别为164 U/g菌体和23 g菌体/L发酵液,即每升发酵液含酶活性3 772 U。纯化的尿酸酶比活性为4.5 U/mg,其最适pH值为7.5,最适温度40℃,酸碱稳定范围在pH值6.0~10.0,温度低于45℃时热稳定性较好。结论以乳糖作为诱导剂培养效果更佳;带有His标签的重组尿酸酶经Ni-琼脂糖凝胶柱亲和层析和Sephacryl S-200HR分子层析后即可获得纯品,纯化流程更为简单;该纯化酶的最适反应温度、最适pH值、酸碱稳定性和热稳定性的确定为其结构与功能的关系以及未来的实际应用提供了一定的实验依据。
- 王颖肖雪李丹钟春燕范翔李刚锐孟尧
- 关键词：尿酸酶产朊假丝酵母
