刘忠顺
- 作品数：11 被引量：12H指数：2
- 供职机构：中国医科大学基础医学院病原生物学教研室更多>>
- 发文基金：辽宁省自然科学基金辽宁省教委基金辽宁省科学技术计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 肺炎支原体重组蛋白抗原的初步鉴定
- 2005年
- 克隆并表达肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1黏附蛋白D-2区基因片段,进而对重组蛋白的抗原特异性进行鉴定.应用PCR技术获取目的基因片段,并构建含有目的基因片段的重组质粒,用重组质粒酶切图谱法、PCR扩增及核苷酸测序方法鉴定重组质粒.而后将其转入大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE分析重组蛋白的相对分子量,免疫印迹实验鉴定其免疫反应性,并用ELISA实验测定重组蛋白抗原的特异性.结果重组质粒中的p1基因片段经测序后,与GenBank中p1基因核苷酸序列比较,其同源性为99.66%～100%;经SDS-PAGE分析,重组蛋白的相对分子量约为 59 ku;免疫印迹实验和ELISA实验证实,Mp免疫血清和Mp感染患者血清都能与重组蛋白发生特异反应.研究中的含P1黏附因子D-2区基因的重组质粒已成功构建,其表达的重组蛋白具有特异的免疫反应性,初步ELISA实验证实,本研究获得的重组蛋白可用于临床标本检测.
- 李保强赵芝娜宋焕景董占双刘忠顺王桂珍
- 关键词：肺炎支原体重组蛋白
- 肺炎支原体重组P1蛋白多克隆抗体的制备及纯化被引量：2
- 2011年
- 目的制备肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)重组P1蛋白多克隆抗体,为Mp抗原诊断试剂的制备奠定基础。方法用Mp重组P1蛋白免疫家兔,ELISA法测定免疫血清抗体效价;硫酸铵沉淀及离子交换层析法纯化抗体;紫外分光光度法测定抗体的浓度;SDS-PAGE分析抗体的纯度;量子点标记纯化抗体,分析抗体的免疫活性;直接免疫荧光法检测抗体的特异性。结果重组P1蛋白兔免疫血清抗体效价为1∶25 600;纯化的抗体浓度为3.689μg/μl;SDS-PAGE显示相对分子质量58 000的重链条带;用量子点标记纯化的抗体仍保持较高的免疫活性,与其他呼吸道常见病原菌均未发生特异性结合。结论获得的纯化Mp P1蛋白IgG抗体具有较高的免疫活性和特异性,可用于临床Mp感染的抗原诊断。
- 曾晶晶王舰赵芝娜刘忠顺董占双王桂珍
- 关键词：P1蛋白多克隆抗体
- 耐甲氧西林葡萄球菌感染基因诊断的实验研究被引量：1
- 1998年
- 目的探明沈阳地区ＭＲＳＡ感染状况及耐药机理。方法采用酶标－多聚酶链式反应（ＥＤ－ＰＣＲ）方法对沈阳地区３所医院分离的７６株葡萄球菌耐甲氧西林（ＭｅｃＡ）基因进行检测。结果ＭｅｃＡ基因阳性２３株，耐甲氧西林葡萄球菌（ＭＲＳ）的检出率为３０．３％，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）检出率占金黄色葡萄球菌总数的２１．７％。采用微量液体稀释法、琼脂稀释法以及ＭＲＳＡ鉴别培养法等３种方法与之相比较，经统计学处理ＥＤ－ＰＣＲ法与其它３种方法的一致性非常有意义（Ｐ＜０．０１）。以ＭＲＳＡ鉴别培养法作为诊断ＭＲＳ的参考标准，ＥＤ－ＰＣＲ法敏感性为９５．５％，特异性为９６．３％。结论ＥＤ－ＰＣＲ法与其它３种方法相比，具有简便、快速、敏感性高。
- 赵玉坤娄金丽李颖刘忠顺刘丽文
- 关键词：MECA基因MRSA
- 肺炎支原体P1蛋白结构基因片段的制备及C末端基因片段克隆的研究
- 2001年
- 目的 制备肺炎支原体P1蛋白结构基因 ,并在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白C末端基因片段 ,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨C末端基因片段功能打基础。方法 PCR扩增方法获取P1结构基因。扩增产物用P1蛋白基因特异引物扩增鉴定。用SalⅠ和EcoRⅠ双酶酶切消化方法制备P1蛋白C末端基因片段 ,并与pUC19DNA连接 ,转入大肠杆菌JM10 9菌株。用X - gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株 ,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定。 结果 经PCR扩增MPDNA获得一条 5 .0kbDNA片段 ,用P1基因区特异引物扩增鉴定获得阳性结果。重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出两条带 ,一条为 pUC19载体DNA带 ,另一条是 1kb的插入片段。
- 王桂珍董占双刘忠顺李保强
- 关键词：肺炎支原体基因克隆
- 肺炎支原体P1重组蛋白的提取纯化及应用研究被引量：6
- 2007年
- 提取纯化肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1重组蛋白,建立酶联免疫吸附实验(ELISA)的方法,协助临床肺炎支原体感染的诊断。以GST融合蛋白层析柱提取、纯化Mp P1重组蛋白做抗原,以全肺炎支原体菌体成分做抗原对照,建立间接ELISA实验方法,检测40份正常献血者血清标本和51份疑似MP感染临床血清标本的IgG抗体。重组蛋白经SDS-PAGE可见诱导表达的样品在分子量大约59 ku处有明显条带,经Western blotting可与肺炎支原体免疫血清发生反应。ELISA实验检测51份临床标本,由P1重组蛋白抗原检测阳性31份,阳性率为60.78%。Mp检测阳性20份,阳性率为39.22%。实验精确度检测阳性混合血清的变异系数(CV值)为5.40%,阴性混合血清变异系数为1.10%。用Mp P1重组蛋白抗原建立的ELISA检测方法,其敏感性高于全肺炎支原体抗原,可用于临床肺炎支原体感染的诊断。
- 宋焕景王桂珍董占双刘忠顺吉兆华周吉海
- 关键词：肺炎支原体重组蛋白
- 培养-增强套式PCR检测肺炎支原体感染被引量：1
- 2002年
- 应用培养 增强套式多聚酶链反应 (C ENPCR)检测 44例肺炎支原体感染住院患儿咽拭子标本。在检测的 44份咽拭子标本中 ,肺炎支原体的检测阳性率为 38.6 3%。结果显示 ,C ENPCR检测MP感染敏感性较高 。
- 董占双刘忠顺王佳贺王桂珍
- 关键词：肺炎支原体
- 血浆凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)对抗生素的敏感性测定及耐甲氧西林机制的初步探讨
- 1999年
- 赵玉坤侯美华依文生刘忠顺丁颖王丹卉晓慧
- 关键词：葡萄球菌抗生素药敏性耐甲氧西林
- 肺炎支原体P1蛋白结构基因的克隆与鉴定
- 2001年
- 目的 :在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白结构基因 ,为实现肺炎支原体P1蛋白结构基因的大量扩增及表达奠定基础。方法 :PCR方法获取肺炎支原体P1蛋白结构基因 ,并与 pUC19载体DNA连接 ,转入大肠杆菌JM10 9菌株。X -Gal平板筛选转化子 ,用PCR方法和限制性核酸内切酶酶切图谱分析方法鉴定重组克隆。结果 :PCR和限制性核酸内切酶图谱分析均证实所获重组质粒中含有P1蛋白基因。结论 :获得了含有肺炎支原体P1蛋白结构基因的克隆菌株。
- 王桂珍李保强董占双刘忠顺刘洪瑞韩雪松
- 关键词：P1蛋白肺炎支原体基因克隆
- 肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中克隆的研究被引量：1
- 2001年
- 在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段 ,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨羧基端基因片段功能打基础。采用PCR扩增方法获取P1结构基因。扩增产物用SalI和EcoRI酶切消化 ,回收 1kb大小的DNA片段并与 pUC19DNA连接 ,转入大肠杆菌JM10 9菌株。用X gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株 ,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定。经PCR扩增MPDNA获得 1条 5 .0kbDNA片段。重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出 2条带 ,1条为pUC19载体DNA带 ,另 1条是 1kb的插入片段。实验获得肺炎支原体P1蛋白结构基因及含P1蛋白羧基端DNA片段的重组克隆株。
- 王桂珍李保强董占双刘忠顺
- 关键词：肺炎支原体基因克隆
- CglI基因在大肠杆菌中的功能活性分析被引量：1
- 2006年
- 通过PCR技术从谷氨酸棒杆菌基因组中扩增CglI基因,克隆到载体pMD18-T Simple后测序。将CglI基因亚克隆到表达载体pJL23,构建重组质粒pJL23-CglI,转化大肠杆菌HB101菌株,通过PCR反应筛选鉴定阳性克隆。通过噬菌体感染实验,初步分析了CglI基因在大肠杆菌中的功能活性。
- 李铁民胡永飞冯倩妮李玉董占双刘忠顺罗恩杰
- 关键词：谷氨酸棒杆菌大肠杆菌噬菌体
