张文帅
- 作品数：23 被引量：101H指数：3
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- 甲型H1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的真核表达与纯化
- 2011年
- 目的构建甲型SWH1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的杆状病毒真核表达载体,转染sf9细胞表达并纯化其编码蛋白。方法从江苏甲型H1N1流感病毒毒株[A/Jiangsu/1/2009(H1N1)]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA1基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/HA1质粒,双酶切pMD18-T/HA1与p-fast后,连接构建真核表达载体p-fast-HA1,转化DH10Bac细胞,转座构建杆状病毒HA1-Bacmid,经酶切及测序鉴定后将HA1-Bacmid转染到sf9细胞中,通过免疫印迹法鉴定HA1蛋白的表达,采用亲和层析法纯化HA1蛋白。结果经双酶切、测序鉴定证实HA1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实HA1基因的表达;纯化获得了高纯度的HA1蛋白。结论成功克隆了HA1基因,并构建了其杆状病毒真核表达载体,该表达载体的构建为后期的流感快速检测以及基因工程疫苗制备奠定了良好的基础。
- 李燕迟莹卞倩温恬张文帅焦永军
- 关键词：HA1基因克隆蛋白纯化
- 江苏省发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒血清流行病学调查被引量：67
- 2011年
- 目的调查江苏省人与动物发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)血清流行病学情况,为控制疫情提供流行病学线索。方法 2010年7-11月在江苏省南京江宁区、溧水县,常州溧阳市,无锡宜兴市,淮安盱眙县和连云港东海县共采集2853份血清,其中人血清1922份、动物(犬、羊、猪、牛、鹅、鼠和鸡)血清931份,运用双抗原夹心ELISA法检测血清中SFTSV总抗体,并进行不同地区SFTSV总抗体阳性率比较。结果本次调查2853份血清样本中SFTSV总抗体阳性血清121份,阳性率为4.24%,提示江苏省存在SFTSV的流行。在7种被调查的动物样本中,5种动物(犬、羊、牛、猪、鸡)血清样本SFTSV总抗体阳性,阳性率分别为6.40%、57.14%、31.82%、5.33%和0.98%;人血清中SFTSV总抗体阳性率为0.94%。血清中SFTSV总抗体阳性率存在地区差异。人群与动物SFTSV血清总抗体阳性率存在正相关关系。结论江苏省是SFTSV的流行区域,需加强SFTSV的预防意识及诊断能力。
- 张文帅曾晓燕周明浩焦永军温恬郭喜玲祁贤史智扬
- 关键词：发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒血清流行病学调查
- H7N9亚型禽流感病毒核蛋白NP原核表达载体的构建与表达被引量：1
- 2014年
- 目的构建甲型H7N9禽流感病毒NP基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒NP基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-NP质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-NP质粒转化表达菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达NP重组蛋白。应用western blot法鉴定NP蛋白的表达。结果成功构建NP基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达出分子量为56kD的NP重组蛋白。结论实现了禽流感病毒H7N9NP重组蛋白在原核系统中的高效表达,为禽流感诊断试剂及单抗的研发工作奠定了基础。
- 张文帅张黎温恬迟莹黄超彭海燕焦永军史智扬
- 关键词：原核表达
- 禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的真核表达及其在细胞中的分布
- 2011年
- 为构建禽流感病毒(AIV)H5N1亚型非结构蛋白NS1的真核表达载体,并鉴定其在哺乳动物细胞中的表达与分布,本研究采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒的总RNA中扩增NS1全长基因,并将其克隆于pXJ40中,构建真核表达载体pXJ40-HA-NS1。将该重组质粒转染293T细胞,通过western blot方法鉴定表达的NS1蛋白;并以免疫荧光技术观察NS1在H1299细胞中的分布与定位。Western blot结果显示NS1基因编码蛋白获得表达,免疫荧光检测显示NS1蛋白主要存在于细胞核中。本研究为NS1蛋白功能和H5N1亚型AIV致病机制的研究奠定了基础。
- 卞倩张文帅迟莹李燕焦永军
- 关键词：H5N1亚型禽流感病毒NS1真核表达
- 甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体的构建与表达被引量：2
- 2011年
- 目的:构建甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏首例甲型H1N1流感病毒毒株(A/Nan jing/1/2009(H1N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。West-ern blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功克隆NS1全长基因,并构建了其真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料。
- 张文帅卞倩温恬迟莹李燕焦永军
- 关键词：甲型H1N1流感病毒NS1真核表达免疫印迹
- 基于上转化发光免疫层析技术建立发热伴血小板减少综合征病毒总抗体快速检测方法被引量：7
- 2015年
- 目的基于上转化发光(UPT)免疫层析技术,建立发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)总抗体的现场快速检测方法。方法将SFTSV重组NP蛋白与上转化发光颗粒(UCP)偶联,制备UCP-NP免疫层析试纸条,评价该试纸条检测SFTSV总抗体的灵敏性、特异性和稳定性,并检测SFTSV血清254份,与酶联免疫法(ELISA)比较。结果该方法可在15min内完成SFTSV总抗体检测,可检测1∶500稀释度的SFTSV阳性血清,与其他出血热病毒无交叉反应,加样14d内稳定性较高。UPT免疫层析法与ELISA法检测临床血清样品一致性极高(Kappa=0.967),约登指数为0.973。结论建立了基于UPT免疫层析技术的SFTSV总抗体快速检测方法,该方法灵敏、特异,且操作简便、快速,结果稳定,适合在基层门诊和体检现场推广。
- 黄超张文帅张黎温恬史凤娟曾晓燕迟莹史智扬焦永军
- 关键词：灵敏度特异性
- H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达被引量：1
- 2013年
- 目的:构建甲型H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并转染293T细胞以表达其编码的蛋白。方法:从南京分离株H7N9流感病毒[A/Nanjing/1/2013(H7N9)]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T载体中构建pMD18-T-NS1质粒,以pMD18-T-NS1质粒为模板扩增NS1基因。双酶切NS1基因PCR产物与PXJ40-MYC后,连接构建真核表达载体PXJ40-MYC-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。Western blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功构建了H7N9非结构蛋白NS1真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究奠定基础。
- 温恬迟莹张黎张文帅彭海燕史智扬
- 关键词：NS1真核表达免疫印迹
- 天然人源性单链抗体文库的构建及鉴定被引量：2
- 2017年
- 目的构建天然人源性单链抗体(scFv)文库,并对文库质量进行鉴定。方法采集220份未经主动免疫健康人外周血,分离单个核细胞后提取总RNA,逆转录成cDNA,混匀,以此为模板PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL,包括Vκ和Vλ),再经过overlap-PCR法,将VH基因和VL基因随机拼接成人scFv基因文库后,插入噬菌体载体pComb3XSS中,电转化大肠杆菌XL1-Blue制备scFv文库。通过菌落数量计算库容,并随机挑选100个单菌落验证scFv基因阳性克隆率,基因测序分析scFv文库基因的多样性。结果经过1次电转化得到容量为1.8×108的scFv文库,scFv基因阳性克隆率为96%,其中78%为正确插入,其scFv基因序列均不相同。结论成功构建了一种大容量、多样性高的天然人源性scFv文库,为进一步筛选特异性中和抗体提供了基础材料。
- 张文帅迟莹焦永军
- 关键词：噬菌体人源PCR库容量多样性
- 抗严重发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白单链抗体的筛选和鉴定被引量：1
- 2019年
- 目的筛选及表达抗严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)包膜糖蛋白(Gn)单链抗体(scFv)。方法利用人源化SFTSV的scFv文库与固相化包被的SFTSV-Gn蛋白特异性结合,经过4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选能特异性结合SFTSV-Gn蛋白的噬菌体scFv,随机挑取最后一轮单菌落进行噬菌体-ELISA鉴定,将经过测序鉴定正确的阳性克隆转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中原核表达,用Western blot法鉴定scFv的表达, ELISA鉴定纯化后scFv的结合活性。结果筛选出3株不同序列的抗SFTSV-Gn蛋白的scFv, Western blot法结果显示scFv得到正确表达, ELISA结果显示纯化后的scFv具有结合活性。结论成功筛选及表达了抗SFTSV-Gn蛋白的scFv。
- 张文帅郭喜玲迟莹焦永军
- 关键词：原核表达
- 应用蛋白组学方法筛选和鉴定乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白被引量：3
- 2009年
- 前S1蛋白(PreS1)在乙型肝炎病毒与宿主的相互作用中起至关重要的作用.为筛选乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白,进一步探讨其在病毒感染过程中的作用,原核表达、纯化了PreS1-谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合蛋白,利用此蛋白与HepG2细胞裂解液进行Pull-down实验,其产物进行双向凝胶电泳分离.结果发现2个PreS1特异结合蛋白,经质谱鉴定为分子伴侣蛋白——葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和葡萄糖调节蛋白75(GRP75).通过免疫共沉淀和Western印迹分析证实,PreS1与GRP75之间存在相互作用.实验结果表明,GRP75为新发现乙型肝炎病毒PreS1特异结合蛋白,其与PreS1结合后的生理功能以及在HBV感染过程中的作用值得深入研究.
- 葛以跃崔仑标史智扬焦永军张文帅汪华
- 关键词：前S1蛋白结合蛋白蛋白组学葡萄糖调节蛋白75
