刘美辰
- 作品数：19 被引量：37H指数：7
- 供职机构：遵义医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金博士科研启动基金贵州省科技厅科学技术基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学更多>>
- 猪带绦虫TSO45W-4B基因在长双歧杆菌中的表达被引量：1
- 2015年
- 目的:在成功构建猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒p GEX-TSO45W-4B的基础上,研究猪带绦虫TSO45W-4B基因在长双歧杆菌中的表达情况。方法:将猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒p GEX-TSO45W-4B电转化入长双歧杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot分析表达情况。结果:酶切、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和测序证实,重组质粒p GEX-TSO45W-4B成功转入长双歧杆菌。SDS-PAGE显示,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为40 k D,经谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)亲和层析后可获得纯度为85%以上的重组蛋白。Western blot显示,重组蛋白能被兔抗TSO45W-4B血清、囊虫病猪血清和囊虫病患者血清所识别。结论:猪带绦虫TSO45W-4B基因能够在长双歧杆菌中获得表达,表达的重组蛋白具有特异的抗原性。
- 周必英刘美辰杨凤娇
- 关键词：猪带绦虫长双歧杆菌
- 不同剂量猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗免疫家猪诱导的免疫应答动态观察被引量：3
- 2014年
- 目的动态观察不同剂量猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗免疫家猪诱导的免疫应答,确定该疫苗的合适免疫剂量。方法将16头40d龄健康家猪随机分为4组,分别以1010、1011和1012克隆形成单位（CFU）猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗经口免疫2次,间隔2周,同时设双歧杆菌液体培养基（MRS）对照组。于免疫后0、2、4、6和8周,前腔静脉取血,分离血清和制备外周血淋巴细胞（PBMC）,采用ELISA法检测免疫猪血清特异性IgG、IgG2a水平及PBMC培养上清液IL-2、IL-4水平。结果免疫猪血清特异IgG水平于免疫后4～8周升高,F值分别为1182.122、412.602、1451.071,于4周达较高水平；IgG2a于2～8周升高,F值分别为288.216、1741.82、1 352.143、201.426,于2周达较高水平。PBMC培养上清液IL-2于免疫后2～6周升高,F值分别为571.912、3 854.482、1 485.647,于4周达较高水平；IL-4于免疫后4～6周升高,F值分别为5443.863、4100.819,于4周达较高水平,与0周时及MRS对照组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）；1011 CFU免疫组血清特异IgG、IgG2a水平和PBMC培养上清液IL-2、IL-4水平与1010 CFU、1012 CFU免疫组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）,1010 CFU、1012 CFU免疫组间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 1010～1012CFU猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗灌胃免疫家猪均可诱导产生有效的免疫应答,其中以1011 CFU免疫组效果较好。
- 刘美辰江强周必英
- 关键词：猪带绦虫免疫剂量
- 3种猪带绦虫重组双歧杆菌候选疫苗在家猪体内的mRNA表达被引量：1
- 2015年
- 目的检测3种猪带绦虫重组双歧杆菌候选疫苗在家猪体内的表达情况。方法将40t3龄健康家猪分别用10n克隆形成单位（colonyformingunits，CFU）的猪带绦虫Bb．TS045W-4B、Bb．TSOL18和Bb-TS045W-4B．TSOL18重组候选疫苗对家猪口服灌胃。首次免疫2周后加强免疫1次。于首免后56d，剖杀家猪。无菌取肝、肺、脾，采用RT-PCR方法检测上述3种候选疫苗在家猪体内的mRNA表达情况。结果在家猪肝脏、肺脏和脾脏中均检测到猪带绦虫TS045W．4B基因的mRNA．其中肝脏和肺脏的相对表达量为3．3，3．3，1肝脏和肺脏的相对表达量高于脾脏；猪带绦虫TSOL18基因在家猪肝脏和脾脏中均有表达，其中肝脏相对表达量为2．6，高于脾脏的1；猪带绦虫TS045W-4B．TSOL18融合基因在肝脏、肺脏和脾脏中均有表达，相对表达量依次为0．2、2．4、2．1。结论3种猪带绦虫重组双歧杆菌候选疫苗可在家猪体内表达．有利于发挥疫苗的免疫效应。
- 周必英刘美辰杨凤娇
- 关键词：猪带绦虫家猪
- 猪带绦虫双歧杆菌表达系统pGEX-TSOL18/B.longum的构建及鉴定被引量：7
- 2014年
- 通过全基因合成猪带绦虫TSOL18基因,将该基因定向克隆至大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-TSOL18,电穿孔法将该质粒导入长双歧杆菌(Bifidobacterium longum),构建猪带绦虫双歧杆菌表达系统pGEX-TSOL18/B.longum,并通过酶切、PCR和测序鉴定。全基因合成了393 bp的TSOL18基因片段。酶切、PCR和测序鉴定结果证明猪带绦虫双歧杆菌表达系统pGEX-TSOL18/B.longum构建成功。
- 周必英刘美辰贺莉芳
- 关键词：猪带绦虫双歧杆菌TSOL18重组菌
- 猪带绦虫重组Bb—TS045W-4B—TSOL18疫苗诱导仔猪的保护性免疫应答被引量：4
- 2015年
- 目的探讨猪带绦虫重组Bb．TS045W-4B．TSOL18疫苗免疫仔猪后，对猪带绦虫卵攻击感染后的保护性免疫应答。方法将20头40日龄健康仔猪按体质量（约15kg）采用随机数字表法分为5组，每组4头。分别为重组b-TS045W．4B—TSOL18疫苗灌胃组、重组Bb—TS045W-4B疫苗灌胃组、重组Bb-TSOLl8疫苗灌胃组、空载体对照组和双歧杆菌液体培养基（MRS）对照组。各疫苗的免疫剂量为1×10“菌落形成单位（CFU），间隔2周免疫1次，共免疫2次。于末次免疫仔猪4周后，各组仔猪用猪带绦虫卵攻击感染，攻击感染后3个月剖杀仔猪，分离猪囊尾蚴，计算减蚴率；前腔静脉取血，分离血清和制备外周血淋巴细胞（PBMC）。酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测血清免疫球蛋白（Ig）G、IgGl、lgG2a水平和PBMC培养上清液中白细胞介素（IL）．2、干扰素（IFN）．1、IL4及IL-10水平；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测PBMC增殖情况。结果猪带绦虫重组Bb．TS045W．4B．TSOLl8、重组Bb—TS045W．4B、重组Bb—TSOLl8疫苗灌胃组减蚴率分别为83．09％、71.36％和74．85％。仔猪血清IgG、IgGl和IgG2a水平组间比较差异均有统计学意义（F=132．348、106．336、596．091，P〈0．05）。其中重组Bb-TS045W-4B-TSOL18、重组Bb-TS045W-4B、重组Bb．TSOL18疫苗灌胃组IgG、IgG2a水平[（366．81±3．84）、（334．94±11．65）、（333．52±11．09），（87．74±0．95）、（84．48±0．80）、（84．30±1．09）mg／L]均高于MRS对照组[（245．94±8．81）、（62．61±0．84）mg／L，P均〈0．05]，IgGl水平[（26．55±1．06）、（33．24±1．92）、（32．60±1．94）mg／L]低于MRS对照组[（42．78±0．87）mg／L，P均〈0．05]。仔猪PBMC培养上清原液中IL-2、IFN-1、IL．4和IL．10水平组间比较差异均有统计学意义（F=139．522、1053．102、769．097、962．298，P均〈0．05）。其中重组Bb．TS045W．4B．T
- 贾启刘美辰周泠杨凤娇江楠王灵军周必英
- 关键词：猪带绦虫保护性免疫应答仔猪
- 猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗不同保存条件下的稳定性研究被引量：4
- 2015年
- 目的研究猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重组双歧杆菌(Bb)疫苗在不同保存条件下的稳定性。方法分别将猪带绦虫重组质粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4BTSOL18电转入长双歧杆菌(B.longum),获得阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEXTSO45W-4B-TSOL18/B.longum,分别置于不同条件下保存,取出菌液,抽提质粒,电泳检测,进行稳定性分析。结果阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum分别在常温下、4℃、-20℃、-80℃、-196℃(液氮中)分别保存48h、1周、1月、2月,抽提质粒,电泳发现阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum在液氮中、-80℃、-20℃中比较稳定,而在普通的室温环境下,很快发生质粒丢失现象。结论猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重组Bb疫苗低温保存最稳定,常温最差,这为猪带绦虫重组Bb疫苗的进一步研究奠定了基础。
- 周必英刘美辰杨凤娇
- 关键词：猪带绦虫稳定性
- 猪带绦虫重组Bb-TSO45W-4B疫苗诱导仔猪保护力及其免疫机制研究被引量：7
- 2015年
- 目的构建猪带绦虫重组Bb-TSO45W-4B疫苗,研究该疫苗诱导仔猪产生的保护力及其免疫机制。方法以猪带绦虫重组Bb-TSO45W-4B疫苗1×1011 CFU灌胃免疫40日龄健康仔猪,同时设空载体对照组和双歧杆菌液体培养基(MRS)对照组,每组4头。每两周免疫1次,共免疫2次。于末次免疫后4周,用猪带绦虫卵进行攻击感染,攻击感染后3个月解剖猪体,摘取囊尾蚴,计算减蚴率;前腔静脉取血,分离血清和制备外周血淋巴细胞(PBMC)。酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测血清IgG、IgG1、IgG2a水平和PBMC培养上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测PBMC增殖情况。结果猪带绦虫重组Bb-TSO45W-4B疫苗免疫仔猪获得71.36%的保护力;与空载体对照组和MRS对照组比较,血清IgG和IgG2a水平显著升高(F=95.055、650.293,P<0.05),IgG1水平显著降低(F=78.422,P<0.05);加抗原刺激时,PBMC增殖水平显著升高(F=107.019,P<0.05);PBMC培养上清液中IL-2和IFN-γ水平显著升高(F=229.668、2251.690,P<0.05),IL-4和IL-10水平显著降低(F=274.832、1168.768,P<0.05)。结论猪带绦虫重组Bb-TSO45W-4B疫苗能够诱导仔猪产生一定的保护力,其中Th1型免疫应答在其诱导的保护性免疫机制中起重要作用。
- 江楠刘美辰周泠杨凤娇贾启王灵军周必英
- 关键词：猪带绦虫保护力免疫机制仔猪
- 重组双歧杆菌研究进展被引量：10
- 2014年
- 双歧杆菌是人和动物肠道内重要的益生菌。近年来,随着基因工程技术的发展,选择具有益生功能的双歧杆菌作为载体传递系统,在细菌、病毒、肿瘤、寄生虫等领域构建了一系列重组双歧杆菌,具有广泛的应用前景。
- 刘美辰贺莉芳周必英
- 关键词：双歧杆菌基因工程
- 猪带绦虫重组双歧杆菌疫苗人工传代后的稳定性研究被引量：5
- 2014年
- 目的研究猪带绦虫TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌(Bb)疫苗人工传代后的稳定性。方法分别将猪带绦虫重组质粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18电转入长双歧杆菌(Bifidobacteria longum),获得阳性菌株pGEX-TSO45W-4B/Bl、pGEX-TSOL18/Bl和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/Bl,分别经人工传代10次后抽提质粒,进行PCR鉴定和稳定性分析。结果经PCR鉴定,从第7代开始,pGEX-TSOL18/Bl菌株出现质粒丢失的现象,随着培养时间的延长,质粒丢失现象越来越严重,第8代,第9代均出现丢失现象。而pGEX-TSO45W-4B/Bl菌株从第8代开始出现质粒丢失现象,随后的第9代,第10代也陆续出现丢失现象。pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/Bl菌株相对稳定,但从第10代开始,开始出现了质粒丢失现象。结论重组质粒转化菌pGEX-TSO45W-4B/Bl、pGEX-TSOL18/Bl和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/Bl人工培养时分别从人工传代培养第8代、第7代和第10代开始出现质粒丢失现象,可稳定遗传7代、6代和9代,显示具有不同程度的遗传稳定性,这为猪带绦虫重组Bb疫苗的进一步研究奠定了基础。
- 周必英刘美辰杨凤娇
- 关键词：猪带绦虫传代稳定性
- 猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在长双歧杆菌中的表达被引量：6
- 2014年
- 目的在成功构建猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的基础上,研究猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在长双歧杆菌中的表达情况。方法将猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18电转化入长双歧杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达情况。结果酶切、PCR和测序证实,重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18成功转入长双歧杆菌。SDS-PAGE显示,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为55kD,与预期结果相一致。Western blot显示,重组蛋白能被兔抗血清、囊虫病猪血清和囊虫病患者血清所识别。结论猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因能够在长双歧杆菌中获得表达,表达的重组蛋白具有特异的抗原性。
- 周必英刘美辰杨凤娇
- 关键词：猪带绦虫长双歧杆菌
