赵洪亮
- 作品数：43 被引量：108H指数：6
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程轻工技术与工程更多>>
- 由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白及其编码基因与应用
- 本发明公开了一种由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白及其编码基因与应用。该融合蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨...
- 刘志敏赵洪亮薛冲王洋熊向华姚学勤李献玉
- 文献传递
- 人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化和活性鉴定被引量：11
- 2005年
- 为了延长人睫状神经营养因子突变体的体内半衰期 ,将人血清白蛋白 (HSA)的C 末端和人睫状神经营养因子突变体AX15 (R13K)的N 末端通过一个 11个氨基酸的连接肽融合在一起 ,构建了融合蛋白HSA AX15 (R13K)。HSA AX15 (R13K)融合蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中进行表达后通过阳离子交换层析、反向层析和凝胶过滤对表达产物进行了分离纯化。体外TF 1细胞存活实验表明与HSA融合并未影响AX15 (R13K)的生物学活性。体内动物实验表明HSA AX15 (R13K)融合蛋白的疗效比AX15 (R13K)更为持久 :每 3天注射一次 4 8mg kg的HSA AX15 (R13K)融合蛋白的治疗效果优于每天注射一次 1 6mg kg的AX15 (R13K)的治疗效果。HSA AX15 (R13K)融合蛋白不但可以减少用药次数 ,提高病人的顺应性 ,而且还可以减少用药量和血药浓度的波动 ,从而降低副反应 ,在临床应用上具有一定的优势。
- 赵洪亮薛冲熊向华张伟杨秉芬刘志敏
- 关键词：睫状神经营养因子巴斯德毕赤酵母
- 人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达被引量：3
- 2008年
- 目的:在巴斯德毕赤酵母中表达有降糖活性的人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1)突变体(2Gly-hGLP-1)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。方法:为将GLP-1氨基酸序列第2位的丙氨酸(Ala)定点突变为甘氨酸(Gly),根据毕赤酵母偏爱密码子合成编码2Gly-hGLP-1的基因;采用重叠PCR法拼接2Gly-hGLP-1和HSA的基因,使得2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽接头连接;将该融合基因插入表达载体pPIC9构建为重组载体pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA,电击转化至毕赤酵母GS115细胞,通过表型筛选和诱导表达实验获得高效表达菌株;工程菌在5L发酵罐中培养后,对发酵产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果:融合蛋白在5L发酵罐中的表达量约为200mg/L,经纯化后纯度可达95%以上;小鼠糖耐量实验表明该融合蛋白具有明显的控血糖活性。结论:在毕赤酵母中分泌表达的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有降血糖活性。
- 龙娟薛冲赵洪亮杨晓红刘志敏
- 关键词：人血清白蛋白融合蛋白毕赤酵母
- 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(sTRAIL)在毕赤酵母中的高效表达
- 2004年
- 从人胎盘总RNA中通过RT PCR方法获得sTRAIL基因的cDNA ,并通过构建高拷贝表达载体在毕赤酵母中获得了高效表达 ,表达量可达 4 0 1mg L。并对表达产物进行了分离纯化和生物学活性分析 ,获得了纯度大于 90 %的纯品 ,该样品能明显表现出诱导L92 9肿瘤细胞凋亡的作用 ,半数致死量为 0 1 8μg mL 。
- 张伟赵洪亮薛冲刘志敏黎明张士猛
- 关键词：TRAIL毕赤酵母
- 一种信号肽及其编码基因与应用
- 本发明公开了一种信号肽及其编码基因与应用。该信号肽其氨基酸序列为序列表中序列1。本发明还公开了编码所述多肽的DNA分子。所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列2。所述多肽和所述DNA分子可在生产蛋白中的应用。本发明还公...
- 刘志敏何庆赵洪亮薛冲
- 文献传递
- 分子伴侣及信号肽对毕赤酵母中分泌蛋白表达水平的影响被引量：2
- 2013年
- 目的：探索定位于细胞质、内质网膜及内质网腔中的分子伴侣及其组合对于带有不同信号肽的胞外β-1，3-葡聚糖酶（EXGl）在巴斯德毕赤酵母GS200中表达水平的影响。方法：通过融合PCR技术分别构建带有酵母a交配因子引导肽序列（仅MF）、酵母仅交配因子信号肽序列（ccPre）和重链结合蛋白（Bip）信号肽序列的报告蛋白EXGl的表达质粒pPIC9-EXG1，同时构建分子伴侣基因及其组合的表达质粒pBLArg-IV，然后将2种重组质粒共转化至毕赤酵母宿主菌GS200，转化子经筛选获得共表达菌株，通过测定EXG1酶活来评价分子伴侣与信号肽对其表达水平的影响。结果：细胞质及内质网膜上的分子伴侣Sec61a、Sec61B及胞质中的分子伴侣Ydjl、Ssal、Hsp104及其组合对各种信号肽引导的报告蛋白EXG1的表达水平没有显著影响。然而，内质网腔中的分子伴侣Bip、EroI、PDI与HacI组合能显著提高报告蛋白EXG1的表达水平，其中，以aMF或ctPre作为信号肽引导的报告蛋白EXG1的表达水平分别提高了2．6倍和3．8倍，以Bip信号肽引导的报告蛋白EXGl的表达水平提高了20％～45％，而对于以EXG1自身信号肽引导的报告蛋白EXG1的表达水平没有显著影响。结论：在酵母表达体系中，内质网腔中的分子伴侣是报告蛋白EXG1表达水平的重要影响因素．但分子伴侣对于信号肽的选择性还须进一步证明。
- 杜济良赵洪亮薛冲任敏刘志敏
- 关键词：分子伴侣信号肽蛋白表达巴斯德毕赤酵母
- 可解离的人胰高血糖素样肽1与人血清白蛋白融合蛋白的构建表达及其初步药代动力学和药效动力学评价被引量：4
- 2015年
- 目的构建4种在体内以不同速率解离的人胰高血糖素样肽1(GLP-1)与人血清白蛋白融合蛋白,探索各种融合蛋白的疗效与其解离速率之间的关系,获得在药代动力学和药效动力学之间保持平衡的最佳融合蛋白。方法通过重叠延伸PCR扩增出具有不同多肽接头的融合蛋白基因,将其克隆到p PIC9载体,电击转化毕赤酵母GS115,经甲醇诱导,分泌表达各种融合蛋白,将各种融合蛋白分离纯化后进行初步药代学和药效学研究。结果融合蛋白与弗林蛋白酶作用后,不可解离的Gly2-GLP-1-GGGGG-HSA融合蛋白未发生解离,而可解离的融合蛋白Gly2-GLP-1-VTR-HSA为慢解离,Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA为中等解离,Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA为快解离。体外生物学活性表明,各种融合蛋白均具有促进MIN6细胞胰岛素分泌的功能。体内药代学检测结果表明,各种融合蛋白在体内的半衰期大小依次为Gly2-GLP-1-GGGGG-HSA、Gly2-GLP-1-VTR-HSA、Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA、Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA。体内药效学检测结果表明,各种融合蛋白均表现出降糖活性,且其活性高低依次为Gly2-GLP-1-VTR-HSA、Gly2-GLP-1-SARSVRA-HSA、Gly2-GLP-1-GRSRVTRSV-HSA、Gly2-GLP-1-GGGGG-HSA。结论引入蛋白酶切割位点后,GLP-1可在体内从融合蛋白中解离,使其恢复生物学活性。只有控制融合蛋白在体内适当的解离速率才能达到最佳疗效,从而在药代动力学和药效动力学性质之间达到平衡。
- 夏姗赵洪亮薛冲吴晓杰李月杜莹莹武福军张娜刘志敏
- 关键词：胰高血糖素样肽1人血清白蛋白药效动力学药代动力学
- 分子伴侣对可溶性肿瘤坏死因子相关促凋亡配体在巴斯德毕赤酵母中表达的影响被引量：3
- 2006年
- 目的:提高外源蛋白可溶性肿瘤坏死因子相关促凋亡配体(sTRAIL)在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达。方法:根据GenBank公共数据库中公布的模式生物酿酒酵母的分子伴侣(Ssa1p、YDJ1、Kar2p和PDI)基因序列设计引物,利用PCR方法从酿酒酵母基因组中得到各基因片段,并将单独Ssa1p或Kar2p、组合YDJ1+PDI、Kar2p+PDI或YDJ1+PDI+PDI分别构建到pPIB2Z表达载体中,并整合到外源蛋白sTRAIL工程菌(毕赤酵母GS115)中进行筛选和诱导表达。结果:SDS-PAGE分析表明,sTRAIL的表达量明显提高,特别是整合了分子伴侣组合YDJ1+PDI的工程菌。Western印迹分析整合的分子伴侣基因后,分子伴侣蛋白在工程菌中的表达量得到了提高。结论:提高细胞内分子伴侣的表达,可以增加外源蛋白的分泌表达,为进一步研究巴斯德毕赤酵母奠定了基础。
- 张伟赵洪亮薛冲熊向华姚学勤王治伟刘志敏陈惠鹏
- 关键词：分子伴侣毕赤酵母
- 巴斯德毕赤酵母表达系统中甘油阻遏相关基因GR1的分离克隆与鉴定
- 2009年
- 目的:分离克隆并鉴定巴斯德毕赤酵母表达系统中甘油阻遏相关基因。方法:PCR扩增LacZ基因,克隆至pPIC9载体,构建pPIC9-LacZ表达载体,经SalⅠ线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115,构建GS115-LacZ模式菌株;用限制酶介导整合(REMI)技术使GS115-LacZ菌体基因组产生随机突变,筛选甘油去阻遏的GS115-LacZΔ菌体;Southern blot鉴定GS115-LacZΔ基因组,用质粒拯救技术和TAIL-PCR克隆未知基因序列并测序。结果:得到甘油去阻遏的GS115-LacZΔ菌体,经Southern blot分析,突变仅发生在1个基因中;通过质粒拯救和TAIL-PCR,分离得到阻遏相关基因GR1,共2863bp,经在线BLAST,发现其编码一种过氧化物酶体自吞噬相关蛋白。结论:分离得到阻遏相关基因GR1,与过氧化物酶体自吞噬相关,提示过氧化物酶体自吞噬相关基因可能对醇氧化酶启动子AOX1的转录活性有影响。
- 姚学勤薛冲赵洪亮何庆孙博刘志敏
- 关键词：巴斯德毕赤酵母TAIL-PCR
- 重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的可溶性表达
- 2005年
- 载脂蛋白AI米兰突变体(apoliproteinA_I_Milano ,AIM)是载脂蛋白AI的天然突变体,具有比载脂蛋白AI更强的抗动脉粥样硬化症的作用。将AIM基因N_末端的氨基酸密码子优化后,克隆至表达载体pET2 2b ,重组质粒转化BL2 1(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达。AIM以可溶形式表达,约占菌体总蛋白的38%。表达产物经ButylSepharose 4F .F疏水层析和QSepharoseH .P .阴离子交换层析后,再用Vivaspin2 0 (30 0 0 0MW)进行超滤,AIM单体的纯度达95 %以上。AIM单体与脂结合活性表明,AIM单体结合脂的速度比apoA_I慢,但结合脂的量比apoA_I高。这项研究为AIM的结构和功能,特别是临床应用研究奠定了基础。
- 黎明赵洪亮薛冲张伟张士猛刘志敏
