谢君
- 作品数：6 被引量：17H指数：3
- 供职机构：复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室更多>>
- 发文基金：上海市自然科学基金国家自然科学基金中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 人g2型溶菌酶的多克隆抗体制备及其在睾丸中的表达分析被引量：3
- 2016年
- 目的以真核表达的人g2型溶菌酶(human goose-type lysozyme 2,LysG2)为免疫原制备抗LysG2的兔多克隆抗体,检测LysG2在睾丸组织中的定位,为阐明其生理功能提供线索。方法对LysG2毕赤酵母GS115转化菌株进行高密度培养,甲醇诱导目的蛋白表达并通过甲壳素亲和色谱纯化,以重组蛋白为免疫原制备兔抗LysG2多克隆抗体。通过ELISA检测抗体效价后,对人体各组织、精子及精液标本进行Western印迹分析,并对人睾丸组织进行免疫组化检测。结果以毕赤酵母表达LysG2为免疫原制备的抗体具有高效价,表达谱分析表明LysG2在睾丸中有表达,在精子蛋白提取物中没有检测到其存在,在精浆中检测到了LysG2。免疫组化检测结果显示LysG2在睾丸中主要定位于间质组织的Sertoli细胞。结论本研究成功以真核表达的LysG2制备了该蛋白多克隆抗体,LysG2在睾丸Sertoli细胞有表达,并分泌到精浆中,提示LysG2可能在男性生殖系统先天性免疫中发挥作用。
- 黄鹏杨智昉谢君徐一新鲍建瑛曹晓娥张宁余龙
- 关键词：毕赤酵母多克隆抗体睾丸先天性免疫
- 甲壳素亲和层析在人g2型溶菌酶制备中的应用被引量：6
- 2015年
- 目的制备甲壳素亲和纯化介质,设计有效的纯化技术路线,对毕赤酵母表达的人g2型溶菌酶(human goose-type lysozyme 2,HLys G2)重组蛋白进行纯化。方法研究碱化、稀酸处理、碱化时间、碱浓度等各种因素对甲壳素介质性能的影响;对重组毕赤酵母进行甲醇诱导表达,依次采用亲和层析、阴离子交换层析、透析等方法从发酵液上清中纯化HLys G2,对最终纯化产物的纯度使用HPLC进行测定,杀菌活性使用双层琼脂平板扩散法进行测定。结果经处理后,在常压下甲壳素亲和介质洗脱速度可达4.5 ml/(min·cm2),对HLys G2吸附容量为1.8 mg/ml,总活性的收率为76.5%,得到的HLys G2纯度>99.0%,对溶壁微球菌具有杀灭活性。结论制备的甲壳素亲和介质具有良好性能,以甲壳素亲和层析为中心的纯化方法可有效纯化HLys G2,为规模化制备HLys G2奠定了基础。
- 黄鹏李文姝谢君鲍建瑛曹晓娥徐一新
- 关键词：甲壳素毕赤酵母纯化
- 7肽和12肽两种M13噬菌体展示库筛选肿瘤坏死因子alpha拮抗肽的比较
- 2017年
- 肿瘤坏死因子alpha的拮抗剂是治疗多种炎症性自身免疫疾病的首选,但抗体类拮抗物因副作用明显而使用受限,尤其是机体内抗抗体的产生,严重影响治疗效果和药物代谢。而肽类物除免疫原性低之外,和小分子相比也有更低的毒性和更强的靶标特异性。使用7肽和12肽两种M13噬菌体展示库筛选TNFα拮抗肽,以分析7肽和12肽分别作为TNFα拮抗肽的亲和性与功能性。经过3~4轮的筛选和验证,得到2条7肽序列和2条12肽序列。利用ELISA方法检测合成肽与TNFα结合的亲和性,编号632的7肽亲和性最强,Kd=138nmol/L;编号636的12肽亲和性稍差,Kd=8.59μmol/L。InsightⅡ软件分别分析632肽和636肽与TNFα二聚体结合,发现632肽与TNFα二聚体结合更加稳定,并且在细胞水平上632肽拮抗TNFα活性功能比636肽更强,有632肽存在的条件下TNFα诱导的L929细胞生存率上升了3倍,而636肽的作用只有2倍。7肽比12肽更适合作为TNFα拮抗肽。
- 胡昌武谢君朱乃硕
- 关键词：肿瘤坏死因子拮抗肽
- 人源类溶菌酶蛋白6在毕赤酵母中的重组表达及活性分析被引量：7
- 2015年
- 利用毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达人源类溶菌酶蛋白6(human lysozyme-like protein6,h Lyzl6),对其酶学性质进行分析。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成h Lyzl6基因,将其连接至含有乙醇氧化酶启动子(AOX1)的p PIC9K质粒构建重组表达载体p PIC9K-hlyzl6;重组表达载体经线性化后电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选获得高拷贝重组菌株后进行甲醇诱导表达。经甲醇诱导72 h后发酵液上清中酶活性达到最高值,发酵液上清经SDSPAGE检测在14.8 k Da处有重组h Lyzl6蛋白条带,分子量符合预期,通过甲壳素亲和层析可对其进行纯化;采用比浊法测定h Lyzl6酶学活性,结果表明h Lyzl6对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)有较好的杀灭作用,最适反应温度为40℃,最适p H为5.5,其酶活力为54 700U/mg,Cu2+对其活性有明显抑制,EC50为30.2799 mg/L。采用基因工程方法首次在毕赤酵母GS115成功表达了重组h Lyzl6,证实其在体外具有杀菌活性,初步揭示h Lyzl6在男性生殖系统先天性免疫中发挥了一定作用,为进一步研究h Lyzl6的功能和应用开发奠定了基础。
- 黄鹏李文姝谢君鲍建瑛曹晓娥余龙徐一新
- 关键词：毕赤酵母杀菌活性
- 以Hoogsteen氢键形成的PNA(T)·DNA(AT)三螺旋更稳定被引量：2
- 2003年
- 肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)是一种核酸类似物,它的骨架以假肽键代替了原来的糖-磷酸骨架.PNA结合到核酸双螺旋上形成三螺旋的过程是PNA作用于核酸双螺旋最初也是最重要的一步.但到目前为止,由于缺乏PNA·2DNA三螺旋的晶体结构数据,关于PNA·2DNA三螺旋的构象特征以及维持其构象作用力的研究还处在初始阶段.本文较成功地搭建了PNA(T)·DNA(AT)三螺旋结构模型.经过优化和分子动力学模拟后,系统分析了它们的构象及其作用力.为肽核酸在反义和反基因策略上的应用提供了可能的理论指导.
- 谢君刘次全屈良鹄
- 关键词：肽核酸稳定性分子动力学
- 蛋白C错义突变Met406Ile致静脉血栓栓塞症的遗传表型及蛋白结构分析被引量：4
- 2013年
- 目的探讨1例蛋白C错义突变（Met406Ile）导致静脉血栓栓塞症的遗传表型和蛋白结构变化。方法对1例遗传性蛋白c缺陷症家系进行家系调查。采用发色底物法检测家系成员蛋白c活性。抽提外周血基因组DNA，聚合聚合酶链反应（PCR）扩增PROC基因9个外显子，利用直接测序法进行基因序列分析。针对先证者突变位点，对其家系成员进行相应位点DNA测序。利用同源模建技术重建突变体Pc三维空间构象，分析突变对其三维空间结构的影响。结果先证者及4位家系成员蛋白c活性不同程度下降，分别为29．7％，42．2％，42．4％，67．3％和70．7％。其中先证者与3位家系成员携带相同突变类型（c．1218G〉A，Met406Ile）。另1家系成员携带PROC基因多态性（rsl799810）。同源模建显示：Met406Ile突变导致氨基酸残基间VDW作用半径减小，其中Gly418：c与Ile406CG2，G1y418：C与11e406HG23，Leu419：N与Ile406：HG23间距离分别减少至2．0733a、1．62045a和1．44652ga突变后Pc蛋白能量由-8．50454kcaL／mol增加至1210．04kal／mol，范德华相互作用能变化显著。结论该PC突变家系的9号外显子c．1218G〉A导致Met406Ile错义突变，突变后局部氨基酸互相碰撞，影响PC蛋白空问结构的稳定性。
- 张岚邓昊昱谢君顾怡沈薇张纪蔚
- 关键词：静脉血栓栓塞症蛋白C突变
