王卫
- 作品数：6 被引量：8H指数：2
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- 稳定转染NOR1抑制5-8F细胞片状伪足形成和Wnt信号通路被引量：2
- 2012年
- 细胞骨架是真核细胞中的蛋白纤维网络结构,不仅与保持细胞形态结构有关,而且影响细胞黏附和细胞运动.NOR1是从鼻咽癌中克隆得到的新基因,在鼻咽癌组织和细胞系中表达下调.本研究建立了NOR1稳定表达的鼻咽癌5-8F细胞系.过表达NOR1引起高转移性鼻咽癌5-8F细胞形态改变,抑制片状伪足形成、细胞表面积缩小、细胞聚集性增强.扫描电镜检测发现,NOR1抑制了5-8F细胞膜微绒毛的数量,引起细胞膜表面改变.细胞骨架染色发现,NOR1过表达导致5-8F细胞actin骨架连续性破坏,应力纤维增加.Realtime RT-PCR检测发现,NOR1引起5-8F细胞Wnt/β-catenin信号通路分子Wnt5A受体FZD5、FZD7表达下调,抑制了β-catenin蛋白入核.提示NOR1抑制Wnt/β-catenin信号通路激活,破坏细胞骨架连续性,抑制细胞膜微绒毛与伪足形成.
- 向波王卫李文娟唐珂曾朝阳李小玲李桂源
- 关键词：鼻咽癌WNT信号通路
- 硝基还原酶结构域蛋白1在大鼠睾丸组织中特异性高表达在人类睾丸癌中表达下调(英文)被引量：2
- 2013年
- 通过克隆分离鉴定得到大鼠硝基还原酶结构域蛋白1(rNOR1),发现rNOR1 cDNA含有1 418个碱基,编码含379个氨基酸残基的rNOR1蛋白.rNOR1与人类NOR1(hNOR1)和小鼠NOR1(mNOR1)的同源性分别为89%和93%,这三种同源蛋白都含有OSCP1家族的保守结构域.rNOR1基因在大鼠睾丸中选择性高表达,而且与之同源的人类hNOR1也选择性高表达于睾丸中.通过免疫组化检测人类不同睾丸癌中的hNOR1蛋白表达,发现hNOR1蛋白在非癌变睾丸组织和胚胎性癌组织中高表达,而在精原细胞癌和分化型非精原细胞癌(畸胎瘤,卵黄囊瘤)中低表达.这些数据表明,hNOR1可能是一种睾丸选择性表达基因,睾丸癌hNOR1表达的改变或许可以帮助我们阐明hNOR1蛋白在生殖细胞系肿瘤发生中的功能.
- 王卫李小玲李文娟易梅唐珂郑盼向波李桂源
- 关键词：肿瘤发生睾丸癌
- DNA甲基化对NOR1基因启动子活性和基因表达的影响被引量：2
- 2012年
- 目的:研究DNA甲基化对NOR1基因启动子活性和表达的影响。方法:采用SssI甲基转移酶处理NOR1基因启动子报告载体,经重亚硫酸钠修饰后测序检测报告载体甲基化水平。未经SssI处理和经SssI处理的NOR1基因启动子报告载体分别转染细胞,检测荧光素酶活性或GFP表达。采用去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理白血病细胞系HL60细胞,抽提RNA,Real-time RT-PCR检测NOR1 mRNA表达水平。结果:重亚硫酸钠测序表明SssI甲基转移酶体外处理导致NOR1启动子CpG岛CG位点完全甲基化。体外甲基化的NOR1启动子活性完全丧失。去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷连续处理3 d后,白血病细胞系HL60细胞中内源性NOR1 mRNA表达水平显著增加。结论:SssI甲基转移酶可用于体外甲基化修饰NOR1基因启动子报告载体。甲基化修饰导致NOR1启动子活性丧失。去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理恢复NOR1 mRNA表达。
- 向波李文娟易梅王卫李小玲李桂源
- 关键词：表观遗传学甲基化启动子
- 鼻咽癌抑瘤基因NOR1第2外显子选择性剪切异构体在组织和细胞中的分布规律(英文)被引量：1
- 2011年
- 目的:研究NOR1基因全长及第2外显子选择性剪切异构体在人细胞系和组织中的分布规律以及NOR1蛋白全长及剪切异构体的亚细胞定位模式。方法:以人胎脑cDNA文库质粒为模板,PCR扩增NOR1基因开放阅读框(open reading frame,ORF),酶切后连接pCMV/myc载体。以pCMV/myc-NOR1(isoform 1)质粒为标准品,采用Real-time RT-PCR方法检测NOR1 mRNA在人胚胎组织和成人睾丸组织中的表达。用RT-PCR方法扩增NOR1基因第2外显子两侧序列片段,测序分析NOR1 isoform 1和isoform 2 mRNA在细胞和组织中的分布;PCR方法扩增细胞系NOR1第2外显子基因组序列,测序检测第2外显子gDNA序列。将pCMV/myc-NOR1(isoform 1)和pCMV/myc-NOR1(isoform 2)质粒转染细胞,采用免疫荧光方法观察两种异构体在细胞内定位模式。结果:从人胎脑cDNA文库克隆得到NOR1基因全长ORF(isoform 1)和遗漏第2外显子的剪切异构体(isoform 2)。Real-time RT-PCR检测发现成人睾丸组织NOR1 mRNA表达水平最高,胚胎鼻咽、气管、脑、肾组织有中等水平表达,其他组织表达较低。RT-PCR结合测序检测发现表明睾丸、鼻咽、气管、肾等16种组织仅表达isoform 2;而脑组织同时检测到NOR1 isoform 1和isoform 2 mRNA,以isoform 2为主。NP69,HNE1等细胞系仅表达遗漏第2外显子的isoform 2,所有检测的细胞系基因组DNA无第2外显子缺失。免疫荧光检测发现NOR1 isoform 1和isoform 2编码蛋白在细胞内定位模式相似。结论:克隆得到NOR1基因全长和遗漏第2外显子的剪切本。Isoform 2是NOR1基因在组织和细胞系中的主要表达形式,NOR1 iso-form 1仅表达于脑组织。第2外显子对NOR1蛋白的细胞内定位模式没有影响。
- 向波王卫易梅李文娟周鸣李小玲李桂源
- 关键词：鼻咽癌选择性剪切亚细胞定位
- 抗癌蛋白NOR1基因工程重组蛋白表达条件的优化和纯化被引量：2
- 2011年
- 目的:构建NOR1基因原核表达载体,并在大肠杆菌中原核表达NOR1重组蛋白,对其诱导条件进行优化,并纯化NOR1蛋白。方法:PCR扩增人NOR1基因全长开放阅读框,克隆入原核表达载体pET28b。重组质粒转化大肠杆菌,采用不同温度、不同抗生素浓度、不同IPTG浓度诱导NOR1蛋白表达。选择最佳条件大量诱导NOR1蛋白表达,采用Ni-IDE树脂纯化NOR1重组蛋白,并通过SDS-PAGE凝胶电泳检测重组蛋白的纯度。结果:成功构建了pET28b-NOR1基因原核表达载体,并转化E.coli Rosettablue(DE3)。利用IPTG诱导His-NOR1蛋白表达,结果发现IPTG浓度、温度、抗生素浓度均可影响NOR1重组蛋白的表达效率。0.25mmol/L IPTG即可诱导NOR1融合蛋白的表达,分子质量为43 kD;随着IPTG浓度提高,重组蛋白表达量增加。温度对NOR1蛋白原核表达有重要影响,低温条件(30℃)无法诱导NOR1蛋白表达。提高卡那霉素筛选浓度可以提高NOR1蛋白表达量。原核表达的NOR1重组蛋白绝大部分形成包涵体,采用6 mol/L盐酸胍溶解包涵体,通过Ni-IDE树脂纯化得到高纯度的His-NOR1重组蛋白。结论:构建了pET28b-NOR1原核表达载体。研究发现在37℃条件下,采用1 mmol/L IPTG,200μg/mL卡那霉素可以高效诱导NOR1蛋白表达。纯化得到高纯度的NOR1重组蛋白。
- 向波王理王卫李文娟易梅李小玲曾朝阳李桂源
- 关键词：鼻咽癌原核表达重组蛋白纯化
- 稳定干扰NOR1基因对HeLa细胞的影响被引量：3
- 2014年
- 目的:研究稳定干扰NOR1基因对宫颈癌HeLa细胞系的影响。方法:采用pSUPER.neo+GFP载体构建靶向NOR1基因的shRNA干扰载体pSUPER-shNOR1-1,pSUPER-shNOR1-2以及无关序列对照载体pSUPER-scramble,通过脂质体转染HeLa细胞,经G418筛选获得稳定干扰细胞系。采用RT-PCR和Western印迹检测NOR1 mRNA和蛋白表达水平。采用MTT法测定细胞生长曲线。采用H2O2处理HeLa细胞,采用Hoechst 33258染色和TUNEL法测定细胞凋亡。Western印迹检测干扰NOR1对HeLa细胞凋亡相关分子Bcl-2,caspase和聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)表达的影响。结果:稳定感染的shRNA干扰载体pSUPER-shNOR1-1和pSUPER-shNOR1-2抑制了HeLa细胞内源性NOR1的基因表达,成功构建了稳定干扰NOR1基因的HeLa细胞系。MTT生长曲线测定表明:与pSUPER-scramble质粒转染细胞相比,稳定转染pSUPER-shNOR1-1和pSUPER-shNOR1-2质粒促进了HeLa细胞的活力和增殖,并抑制了H2O2诱导的HeLa细胞凋亡。Western印迹检测发现稳定干扰NOR1抑制了H2O2诱导的HeLa细胞caspase 9和PARP的活化,上调了Bcl-2蛋白的表达。结论:稳定干扰NOR1基因促进了HeLa细胞的活力与生长,并抑制了H2O2诱导的细胞凋亡,其机制与干扰NOR1表达引起抗凋亡分子Bcl-2表达增加和抑制caspase 9活化有关。
- 谭怡忻李文娟易梅王卫郑盼张海静向波李桂源
- 关键词：宫颈癌RNAI凋亡
