满坤
- 作品数：8 被引量：18H指数：3
- 供职机构：北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心更多>>
- 发文基金：北京市科技计划项目北京市自然科学基金北京市农林科学院科技创新能力建设专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 利用玉米作为生物反应器表达PEDV中和表位抗原蛋白被引量：3
- 2014年
- 以玉米为生物反应器,将猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)主要中和抗原表位(core neutralizing epitope,COE)基因导入玉米自交系,获得了高效表达PEDV-COE的转基因玉米稳定株系。首先,根据玉米密码子的偏好性,设计合成优化的COE编码基因,构建了植物表达载体p BAC9036。然后,利用PDS1000/He基因枪转化玉米幼胚,经过愈伤组织诱导、分化再生培养,获得71株转化再生植株,进而通过田间草甘膦抗性筛选,获得2个T1代转基因玉米稳定株系。通过PCR、RT-PCR、间接ELISA和Western blot等鉴定结果显示,COE基因已成功整合到玉米基因组并进行了转录和蛋白表达。并且种子中COE蛋白占可溶性总蛋白的0.122%和0.078%。最后,提取转基因玉米稳定株系的种子可溶性蛋白,与佐剂混合皮下注射免疫小鼠并取可溶性蛋白灌胃免疫小鼠,均可产生针对PEDV抗原的特异性抗体。获得的转基因玉米可有效表达COE蛋白,表达产物具有显著的免疫原性,为进一步研制PEDV-COE转基因玉米疫苗奠定了基础。
- 满坤杨兵薛静覃湘婕周宏专徐福洲许承扬杨凤萍张立全李向龙张晓东王金洛
- 关键词：猪流行性腹泻病毒转基因玉米
- 拯救鸡传染性贫血突变株对宿主细胞生长周期及凋亡的影响
- 2011年
- 通过流式细胞术,观察拯救鸡传染性贫血病毒突变株(CIAVM突变株)对宿主细胞MSB1的生长周期及凋亡的影响。拯救CIAVM突变株接于MDCC-MSB1细胞系,并相应设立阴性组(正常SPF鸡肝脏细胞液),阳性组(CUX-1标准毒株),进行培养24～48h。用PI及FITC Annexin V染色方法,用流式细胞仪测定宿主细胞生长周期及凋亡,并用SPSS13.0进行结果统计学分析。接种拯救CIAV M突变株的宿主细胞G0/G1期的累积细胞百分率为(59.33±4.04)%,S期为(32.92±3.65)%,G2/M期为(7.75±3.11)%,与阴性组相比,G0/G1期细胞累积百分率有所上升;与CUX组相比,G0/G1期有所下降,但结果经统计学分析,差异均不显著(P>0.05)。试验组宿主细胞凋亡率为(37.00±4.65)%,与阴性组相比,凋亡率上升,统计学差异显著(P<0.05);与阳性组相比,凋亡率下降,统计学差异显著(P<0.05)。试验结果显示,经过VP3基因突变的CIAV M突变株,经过病毒拯救并回归SPF鸡后,对宿主细胞MSB1的生长周期没有显著的抑制,但能引起宿主细胞的显著性凋亡,且凋亡程度与CUX-1引起的宿主细胞凋亡率相比有所降低。可以表明,通过VP3密码子移位的基因突变,能够将CIAV的致凋亡作用降低,从而相应降低病毒的致病性,为以后构建CIAV减毒疫苗株奠定理论基础。
- 孙丹丹杨兵史万玉苏霞满坤
- 关键词：凋亡
- 转基因玉米表达的猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白免疫原性鉴定被引量：3
- 2012年
- 为鉴定猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(TGEV-S)在转基因玉米中的表达及对试验小鼠的免疫原性,本试验在前期TGEV-S转基因玉米植株构建成功的基础上,自玉米叶片中抽提可溶性蛋白作为包被抗原,建立筛选表达TGEV-S转基因玉米的间接ELISA检测方法。结果显示在92份被检测植株中8株为阳性,取阳性值较高的2株152-3和156-6,提取叶片可溶性蛋白,与弗氏佐剂乳化后皮下注射免疫小鼠,只有植株156-6中可溶性蛋白免疫小鼠可产生针对TGEV的抗体,而152-3免疫组检测结果为阴性。利用156-6植株叶片对小鼠进行灌胃免疫,也可产生针对TGEV的特异性抗体。以上结果表明,获得的TGEV-S转基因玉米植株不但可表达TGEV-S蛋白,而且该蛋白通过注射或口服途径免疫小鼠后均可产生针对TGEV-S的特异性抗体,提示TGEV-S转基因玉米具有发展成为TGEV口服疫苗的潜力。
- 许承扬满坤张晓东杨兵王金洛吴国娟
- 关键词：猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白转基因玉米免疫原性
- 猪流行性腹泻病毒中和抗原表位基因的原核表达、纯化及免疫原性鉴定被引量：2
- 2013年
- 为了获得具有免疫原性的猪流行性腹泻病毒(PEDV)主要中和抗原表位(COE)蛋白及其多克隆抗体,试验对已发表的PEDV基因序列进行比对,并设计、合成COE编码基因(420 bp),将其克隆入原核表达载体pET-30a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达,利用胶体金和Western-blot方法检测表达产物;纯化后免疫兔制备高免血清,并利用ELISA方法检测血清抗体效价。结果表明:表达的重组蛋白可与PEDV特异性抗体结合;免疫兔后获得的血清抗体效价达1∶6 400,具有免疫原性。
- 满坤杨兵覃湘婕周宏专张晓东徐福洲王金洛
- 关键词：猪流行性腹泻病毒原核表达纯化免疫原性
- 猪传染性胃肠炎病毒S基因不同编码区的表达和反应原性鉴定被引量：1
- 2014年
- 通过原核表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因不同编码区,以鉴定不同编码区表达产物与TGEV抗体的结合能力。在对TGEV S蛋白抗原位点分析的基础上,针对S蛋白N端的4个抗原位点C、B、D和A,设计引物分别扩增含C、B位点的TCB片段(411 bp)、含D位点的TD片段(441 bp)和含A位点的TA片段(456 bp),经克隆测序后分别插入原核表达载体p ET-32a中进行表达,SDS-PAGE电泳显示各片段均高效表达,表达的TCB片段、TD片段和TA片段融合蛋白大小分别为34.6,35.1,36.1 k Da。Western Blot结果表明,表达蛋白与TGEV感染猪阳性血清和His标签抗体均产生阳性反应。结果显示,3个S基因编码片段均具有与TGEV抗体结合的能力,为进一步鉴定不同编码区的免疫原性及抗原保护能力奠定了基础。
- 周宏专覃湘婕杨兵徐福洲满坤苏霞张晓东刘爵罗绪刚王金洛
- 关键词：猪传染性胃肠炎病毒S基因原核表达反应原性
- 五株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及序列分析被引量：5
- 2016年
- 为研究猪流行性腹泻病毒的流行情况并分析该病毒的培养特性,对甘肃、北京、河北、山西、浙江五个猪场送检的疑似猪流行性腹泻病猪小肠内容物,用RT-PCR方法进行检测,证明为猪流行性腹泻病毒核酸阳性。然后将阳性病料进行传代培养、病毒含量测定以及特异性检验,证明获得五株猪流行性腹泻病毒,分别命名为Ningxia9、Beijing5、Gaocheng8、Shanxi1、Zhejiang08。对分离的毒株进行S基因全长测序及氨基酸序列分析。结果表明：五株分离毒株在盲传19代开始出现明显的细胞病变,盲传到24代,出现稳定的细胞病变且五株分离毒株的24代病毒含量在104.5-5.0TCID50/m L之间;用S蛋白进行进化树分析表明,五株分离毒株与近年来国内流行毒株亲缘关系很近,在同一个进化分支上;分离的五株野毒株之间的氨基酸同源性高达99.2%-99.9%,而这五株野毒与Gen Bank上提交的2011年、2012年分离的野毒株的之间的氨基酸同源性为98.4%-99.9%;实验室分离毒株及国内近年流行毒株均与国内外经典毒株存在一定的共性,即特定位置氨基酸的插入、缺失或置换。
- 王贵华于萍萍满坤吴珊珊刘明明孟萌赵亚荣
- 关键词：猪流行性腹泻病毒
- PEDV-COE基因在转基因玉米中的表达及免疫原性的鉴定
- 本实验设计合成猪流行性腹泻病毒(PEDV)主要中和抗原基因(COE基因),将其克隆到植物表达载体pBAC9036中,该表达载体以编码除草剂草甘膦抗性的EPSP基因作为选择标记。用PDS1000/He基因枪转化玉米幼胚,经...
- 满坤张晓东杨兵徐福州王金洛吴国娟
- 关键词：转基因玉米免疫原性疫苗开发
- 病鸽肠道中蜡样芽孢杆菌的分离及鉴定被引量：5
- 2017年
- 猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteri．tisvirus，TGEV）属于冠状病毒科冠状病毒属，是引起仔猪病毒性腹泻的重要病原。由猪传染性胃肠炎病毒引起的猪传染性胃肠炎是一种急性、高度接触性传染病，以呕吐、严重水样腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪的高度致死率为特征。不同年龄及品种的猪对猪传染性胃肠炎病毒均易感，
- 满坤于萍萍汤波刘明明王贵华
- 关键词：蜡样芽孢杆菌猪传染性胃肠炎病毒肠道病鸽接触性传染病冠状病毒属
