高萍
- 作品数：23 被引量：58H指数：5
- 供职机构：第四军医大学唐都医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- survivin基因启动子调控的HSV-tk真核表达载体的构建及在人喉癌细胞中的特异性表达被引量：1
- 2006年
- 目的构建survivin基因启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶(humansimplexvirus-thymidinekinase,HSV-tk)真核表达载体,检测其在人喉癌细胞中的表达。方法PCR克隆survivin基因启动子与tk基因,双酶切后分别插入pCI-neo真核表达载体中,酶切鉴定后用脂质体法转染喉癌细胞(Hep-2)和正常细胞(7702),RT-PCR法比较两种细胞tk基因的表达情况。结果成功构建了survivin启动子调控的tk基因真核表达载体pCI-neo/survivin-tk;并通过RT-PCR检测出survivin启动子调控的表达载体在喉癌细胞中有表达,而在正常细胞中无明显表达。结论survivin启动子具有肿瘤特异性,有可能解决喉癌基因治疗中的特异性杀伤问题。
- 卞卡张惠中高萍王燕成诗银
- 关键词：SURVIVIN基因启动子喉癌TK基因
- 凋亡抑制因子反义核酸对肝癌细胞生物学作用研究被引量：5
- 2005年
- 目的探讨survivin反义寡核苷酸对人肝癌细胞凋亡、增殖的影响。方法设计合成特异性sur-vivin的反义寡核苷酸(ASODN)。以高表达survivin基因的人肝癌细胞系(SMMC-7721)为靶细胞、反义sur vivin(AS-ODN)为阻断剂,倒置显微镜观察细胞形态变化,WesternBlot法检测细胞survivin表达情况,MTT试验观察AS-ODN对该细胞系的生长抑制作用,流式细胞仪分析细胞增殖周期。结果AS-ODN明显抑制了SMMC-7721肝癌细胞的生长,细胞分裂阻滞在分裂期的中期,并诱导细胞发生凋亡,而各对照组细胞生长良好,细胞增殖指数明显低于各对照组(P<0.05)。结论survivingASODN能下调其蛋白表达,诱导人肝癌细胞凋亡,抑制细胞增殖。
- 高萍林芳
- 关键词：反义核酸凋亡抑制因子肝癌细胞
- 凋亡抑素启动子介导肿瘤特异性TRAIL在宫颈癌Hela细胞中的表达
- 2006年
- 目的:探讨凋亡抑素(survivin,SVV)启动子调控的TRAIL肿瘤细胞内特异表达在宫颈癌治疗中的应用意义。方法:提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR方法,用带有IL-2信号肽基因序列的引物扩增TRAIL基因,克隆入真核表达载体pGL-Basic/surp中SVV启动子的下游,构建肿瘤特异性分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL。转染宫颈癌Hela细胞及正常人肝细胞(7702),RT-PCR鉴定转染细胞中的TRAIL表达。结果:RT-PCR扩增得到了613bp的cDNA片断,pGL-Basic/surp/TRAIL经酶切及测序鉴定与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致;转染细胞RT-PCR鉴定结果显示,Hela细胞中可扩增出600bp基因片段,而7702细胞中未见该特异性扩增条带。结论:重组真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL能够高效、特异性地表达于Hela细胞中,其成功构建为特异性肿瘤基因治疗提供了可行的理想工具。
- 高萍林芳闫凯麟
- 关键词：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体聚合酶链反应
- 特发性无/少精症患者精子发生相关基因DAZ,DAZLA的微缺失被引量：2
- 2003年
- 目的 :研究DAZ和DAZLA基因在特发性无精症和严重少精症患者中的微缺失 .方法 :采用聚合酶链反应(PCR)技术检测 38例特发性无精症或严重少精症患者及 2 0例正常生育男性基因组DNA的DAZ和DAZLA基因位点 .结果 :38名患者中 3例有DAZ基因缺失 (无精子症 2例 ,严重少精子症 1例 ) ,1例DAZLA基因缺失 (无精症患者 ,该患者同时伴有DAZ基因缺失 ) .2 0名正常男性中DAZ及DA ZLA基因均得到扩增 .结论 :DAZ和DAZLA基因的微缺失可能与部分无精症和严重少精症的发病机制相关 ,是造成男性不育的重要原因之一 .
- 赵静姚元庆李东红杨艳红高萍
- 关键词：DAZ基因无精子因子少精症
- 鼠源性抗HBV-TP可变区抗体基因的克隆及原核表达
- 2005年
- 目的: 扩增鼠源性抗HBV末端蛋白(HBV -PT)mAb轻、重链可变区(VL, VH)基因, 构建sFv原核表达载体并于大肠杆菌中表达. 方法: 从鼠源抗HBV末端蛋白杂交瘤细胞(E3)中提取细胞总RNA, 逆转录成cDNA, 以鼠源简并性引物PCR扩增抗体的VL和VH基因, 克隆到pGEM -TEasy载体, 测序并对其结构进行分析. 选择序列正确的克隆,分别构建VL及VH 的PBV220原核表达载体, 42℃诱导表达,Westernblot鉴定表达产物. 结果: 经测序证实,所克隆的VL基因为363bp,VH基因为375bp, 两者序列与鼠抗体的同源性均大于80%. 构建了鼠抗HBV PT抗体基因VL及VH 的PBV220原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达. 表达产物经SDS -PAGE及Western印迹分析与羊抗鼠IgG产生特异反应. 结论: 抗HBV末端蛋白轻、重链可变区基因的克隆及表达为进一步探讨HBV感染患者的免疫治疗奠定了基础.
- 高萍万晓蓉林芳张惠中
- 关键词：杂交瘤
- 诱骗寡核苷酸下调MKN-45细胞OP18基因表达及对细胞增殖的影响
- 2007年
- 目的:探讨转录因子E2F哑铃形诱骗寡核苷酸(Decoy ODNs)对MKN-45细胞中op18基因转录调控的影响及对细胞增殖的抑制作用.方法:设计合成针对op18启动子上E2F的结合位点序列的哑铃形Decoy ODNs,然后将合成的序列进行退火、连接,使其形成哑铃形的结构,再应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将哑铃形Decoy ODNs转染MKN-45细胞中.TRIzol法提取细胞总RNA,用RT-PCR方法检测细胞中op18 mRNA表达水平的变化.通过MTT实验监测细胞的生长增殖状况并绘制生长曲线,最后用TUNEL法观察细胞的凋亡的情况.结果:哑铃形Decoy ODNs被成功转染MKN-45细胞,并成功提取了细胞总RNA.RT-PCR检测发现哑铃形Decoy ODNs转染后的MKN-45细胞中op18 mRNA表达水平明显低于空白对照组,MTT实验所作的生长曲线显示转染细胞增殖速度与空白对照组相比较明显减慢,TUNEL凋亡染色可见凋亡细胞.结论:哑铃形Decoy ODNs能特异性抑制E2F转录因子对op18基因的转录调控,进而抑制op18基因表达及MKN-45细胞增殖.
- 林芳王锐高萍刘丽王希张惠中
- 关键词：圈套寡核苷酸细胞增殖基因疗法
- 靶向微管解聚蛋白stathmin siRNA对Aβ1-42诱发PC12细胞损伤的保护作用
- 2012年
- 目的:探讨微管解聚蛋白stathmin siRNA对β淀粉样蛋白片段(Aβ1-42)诱导PC12细胞损伤的保护作用。方法:构建靶向stathmin基因的shRNA真核表达载体;然后用脂质体转染的方法将重组质粒转染至大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞,用G418筛选得到稳定转染的细胞;通过RT-PCR和Western印迹方法分析stathmin基因mRNA及蛋白表达水平,筛选表达最低的稳定细胞株。用不同质量浓度的Aβ1-42诱导稳定细胞株,用MTT试验观察筛选稳定细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:与对照组比较,转染了重组载体pSilencer4.1-s的细胞中stathmin核酸和蛋白水平的表达均显著下调。与Aβ1-42处理的PC12细胞(63.88±2.36)和PC12-parental细胞(65.78±5.74)比较,Aβ1-42处理的PC12-s细胞(78.57±5.22)的存活率明显增加。用Aβ1-42处理过的PC12细胞(28.31±1.65)和PC12-parental细胞(26.65±3.64)的凋亡比用Aβ1-42处理过的PC12-s细胞(17.77±2.37)的凋亡明显增加。结论:Stathmin基因的下调对Aβ1-42诱导PC12细胞损伤具有保护作用,为阿尔茨海默病的治疗探索了一条新策略。
- 林芳高萍刘昕阳和婷张惠中
- 关键词：STATHMINPC12细胞Β淀粉样蛋白
- SRG基因的克隆及原核表达
- 2007年
- 目的克隆SRG基因、原核表达并鉴定。方法从培养的人骨肉瘤细胞SOSP-9607中提取总RNA,经RT-PCR获得SRG基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy克隆载体中,测序、鉴定。将测序正确的SRG基因亚克隆到pET-28(a+)表达载体中,构建SRG表达载体,IPTG诱导表达2h^6h,做SDS-PAGE分析,鉴定SRG蛋白的表达。结果DNA测序证明,获得了SRG基因,其序列与GenBank中报道序列完全一致。SDS-PAGE分析表明,SRG蛋白获得高效表达,其相对分子质量为22kDa,表达量约占菌体总蛋白的25%。结论SRG基因的克隆和表达均获得了成功,为进一步探讨SRG基因在骨肉瘤诊治中应用奠定了基础。
- 闫露高萍栗艳鱼兵
- 关键词：逆转录PCR基因表达
- 凋亡抑制蛋白Livin两种异构体原核表达载体的构建及融合表达
- 2007年
- 目的构建凋亡抑制蛋白Livin两种异构体(Livinα和β)的原核细胞表达载体pET32a(+)-livinα和pET32a(+)-livinβ。方法设计合成扩增Livin基因异构体全长cDNA序列的特异性PCR引物,以Hela细胞总RNA为模板,RT-PCR获得Livin基因异构体全长cDNA序列,用限制性内切酶BamHⅠ和HandⅢ双酶切取所需目的片段,并插入原核表达载体pET32a(+)的多克隆位点,经酶切、PCR鉴定,并经过测序证实后,构建成为Livin基因异构体表达载体(pET32a(+)-livinα、β)。将重组质粒转入表达菌株BL21,诱导表达收集菌液,超声碎菌,取其上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳。结果成功获得Livinα和β全长cDNA序列,并克隆到原核表达载体pET32a(+)上;成功获得大小为55kd左右的融合蛋白。结论Livin基因两种异构体原核表达载体的构建及其融合蛋白的制备,为进一步研究Livin异构体功能及在肿瘤细胞中的抗凋亡效应奠定了基础。此蛋白也可用于进一步抗体制备、免疫鉴定和诊断等研究。
- 邹爱民沈建军高萍林芳张惠中
- 关键词：凋亡抑制蛋白LIVIN凋亡原核表达
- 抗HBV末端蛋白杂交瘤细胞系的建立及其单克隆抗体鉴定被引量：3
- 2003年
- 目的 :制备分泌抗乙型肝炎病毒末端蛋白mAb杂交瘤并研究杂交瘤细胞及所产生抗体的特性 .方法 :用经原核表达的乙型肝炎病毒末端蛋白 (HBV TP)免疫BALB/c小鼠 ,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2 /0融合 ,经筛选和克隆化建立杂交瘤细胞系 ,然后用ELISA法筛选出阳性克隆 .以免疫组化ABC方法研究杂交瘤细胞分泌的mAb特性 .结果 :共筛选出 3株能持续、稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系 ,其杂交瘤细胞经过 1 0 0d连续培养 ,mAb分泌稳定 ,特异性强 ,腹水抗体效价免疫组化ABC法 1∶1 0 0 0 .免疫组化检测显示其相应抗原在肝炎及肝硬变组织中呈高表达 (80 % ) ,正常肝组织中未见阳性反应 ;其抗原主要分布于细胞质内 .结论 :此 3株抗乙型肝炎病毒末端蛋白杂交瘤细胞分泌的mAb具有特异亲合性 。
- 赵玉红高萍
- 关键词：HBV杂交瘤单克隆抗体免疫组化
