陈妍
- 作品数:21 被引量:40H指数:4
- 供职机构:华中科技大学同济医学院更多>>
- 发文基金:国家重点基础研究发展计划艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项国家科技重大专项更多>>
- 相关领域:医药卫生生物学更多>>
- 鼠IgG定量ELISA实验参比品的制备及其应用
- 2007年
- 目的 制备一组用于小鼠IgG定量ELISA检测的实验参比品。方法 将三株杂交瘤细胞制备的小鼠腹水等体积混合,以葡萄球菌A蛋白(SPA)亲和层析纯化IgG,凯氏定氮法测定IgG含量,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳作纯度鉴定并据此校正其IgG浓度,以特定保存液将其稀释成既定浓度系列,根据其在ELISA中的反应特征,制备浓度(自然对数)-A450值标准曲线,并将其用于对一组杂交瘤细胞培养上清中鼠单克隆抗体的IgG定量测定。结果提纯的鼠IgG经鉴定纯度达97.1%,且反应特性良好,其IgG含量与ELISA检测信号间有高度的相关性(r=0.990)。不同浓度的稀释系列经8次反复冻融,检测信号无显著变化,变异系数(CV)为1.87%~6.47%。将标准曲线计算所得浓度对设定浓度做回收实验分析,回收率89.1%~108.3%。并用其测得一组杂交瘤细胞培养上清的鼠IgG含量为8.0~51.5mg/L。结论 鉴定结果显示制备物定量准确,浓度范围适中,稳定性好,对于早期杂交瘤细胞分泌能力以及抗体稳定性的评价、单抗制剂的鉴定具有一定的应用价值。
- 黄永国张春燕龚劲松陈妍张波李方和
- 关键词:酶联免疫吸附试验单克隆抗体小鼠
- 用多糖-破伤风类毒素结合苗制备抗流行性脑膜炎球菌多糖单克隆抗体被引量:4
- 2011年
- 目的 研制抗A群奈瑟脑膜炎球菌荚膜多糖单克隆抗体(GAMP mAb).方法 以A群奈瑟脑膜炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素(GAMP-TT)耦联物免疫BALB/c小鼠,用常规细胞融合与克隆化技术获得一株能稳定分泌抗GAMP mAb的杂交瘤细胞株(2E7).采用秋水仙素阻断法测定其染色体数目,降植烷诱导法制备含该抗体的小鼠腹腔积液,辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)灰度扫描测定提取物纯度,改良过碘酸盐氧化法制备辣根过氧化物酶(HRP)标记抗GAMP mAb,并采用中和法及其抗原替代法对抗GAMP mAb的特异性进行初步的鉴定.结果 所获得的杂交瘤细胞(2E7)具有很好的生长特性,染色体数目约为139.73条;抗体分泌量适中,Ig亚类为IgG1,提取物浓度1.76~2.32 mg·mL-1,纯度97.2%,标记抗GAMP mAb的效价为1:25 600;抗原替代实验与中和实验对其特异性考核,初步结果证实2E7 mAb具有很好的抗GAMP特异性.结论 成功制备抗GAMP mAb,为GAMP-TT疫苗的生产监测及产品质量控制提供了必要的物质基础.
- 李佩珊张春燕李时君陈妍项美娟李方和张洪
- 关键词:菌苗多糖抗体单克隆抗体
- 抗HBs mAb的研制及其对野生与免疫逃逸变异HBsAg的交叉反应特征被引量:9
- 2008年
- 目的:抗HBs G6mAb制备及其对重组野生与免疫逃逸变异HBsAg结合能力与特点的评价。方法:常规制备并纯化抗HBs mAb,以纯化抗HBs mAb IgG包被,采用ELISA对17种野生及“a”决定簇替代性变异全基因重组表达HBsAg进行检测,并与几种市售HBsAg检测试剂进行比较。结果:该杂交瘤细胞生长与分泌特性稳定,其培养上清与腹水效价分别为2048及4096×10^3;对野生HBsAg检测(ELISA)敏感性不低于0.125μg/L。该抗体可与15种变异抗原中12种发生反应(P/N≥2.5),反应信号强度分别为低反应组(2份,与野生株A值比较,下同)平均7.55%;中反应组(1例)为59.40%;高反应组(9种)分别为野生株的92.1%-109.4%,低反应或无反应表达产物的免疫逃逸变异部位集中在HBV“a”决定簇I环的起始部即120-124序列之间。部分表达产物采用市售试剂作同步检测,平均显色强度高于或明显高于几种国内应用最为普遍的HBsAg ELISA(P〈0.05)。结论:抗HBs G6 mAb对多数免疫逃逸变异HBsAg有很强的结合能力,所针对的变异类型亦表现出某种特殊的规律。
- 李方和张小燕严兵张波黄永国张春燕龚劲松陈妍刘静华
- 关键词:基因变异HBSAG免疫逃逸
- 抗HBV G145R HBsAg多克隆抗体的制备与鉴定
- 2008年
- 目的实验性rG145R变异抗HBs多克隆抗体。方法采用纯化全基因重组G145R变异HBsAg常规皮下免疫制备小鼠多克隆抗体,以间接ELISA、SDS-PAG及Western blot等多种实验对制备物进行鉴定,并初步应用于转染CHO细胞的化学染色。结果制备物在Western blot、ELISA中和试验与抗原替代ELISA中与重组G145R变异HBsAg及重组野生HBsAg等均有很好的特异性与反应性;对此两种抗原的ELISA效价前者显著高于后者(分别为51200与6400);将其用于2A8细胞(转染并分泌G145R HBsAg)爬片的PAP染色,亦取得较理想的实验结果。结论采用重组G145R变异HBsAg免疫成功制备出较高效价的抗体。鉴于该抗体同时与野生重组wHBsAg存在较强交叉反应,其与野生抗HBs的混合应用能增ELISA免疫逃逸变异的检测能力。
- 李佩珊龚劲松李时君张波陈妍项美娟李方和
- 关键词:乙型肝炎病毒基因变异合成肽多克隆抗体
- 实验动物终末处置的新方法——锐性弹切脊髓高位离断术被引量:1
- 2010年
- 急性生命剥夺(宰杀)是一项与动物福利相关且经常发生的重要事件。对实验动物处死的方法必须尽可能做到不给其带来过多痛苦;不干扰或基本不干扰动物临终前的生理状态;不损坏科学实验研究的靶器官(或组织);不对实验者造成过大的心理冲击。常用方法有脊髓牵拉断裂法、
- 李佩珊张春燕李时君陈妍李方和
- 关键词:实验动物脊髓离断术动物福利生理状态
- G145R变异重组HBsAg ELISA检测质控参照品制备的初步研究被引量:3
- 2007年
- 目的:实验性制备G145R变异重组乙型肝炎表面抗原(rHBsAg)质控参照品。方法:收集含G145R变异rHBsAg的细胞培养上清,采用50%饱和硫酸铵盐析,根据其在D12-ELISA中的检测信号,以卫生部颁布的HBsAgELISA质控血清精确标定盐析物中靶物质的含量,适量稀释分装,置-20℃冻存。采用不同方法对制备物的特异性与稳定性进行考核,并将其试用于对几种市售试剂盒检测变异能力的评价。结果:制备物中靶物质含量在0.50~32.00ng/mLwcHBsAg之间,在D12-ELISA检测中其信号的线性关系与质控血清有很好的一致性;反复冻融对其稳定性无显著影响;采用不同市售ELISA试剂检测时其反应信号强度各不相同。结论:本研究制备的G145R变异rHBsAgELISA质控参照品具有较高的稳定性、特异性与实用性;其研制为乙肝病毒免疫逃逸现象在基础、临床、诊断试剂研发,以及流行病学调查等方面研究的开展提供了重要的物质基础。
- 张波陈妍龚劲松张春燕黄永国张小燕田拥军杨东亮李方和
- 关键词:酶联免疫吸附测定
- 重组G145R HBsAg亲和纯化方法的建立及其应用被引量:4
- 2007年
- 目的建立重组乙型肝炎病毒G145R变异HBsAg抗体亲和纯化方法。方法用抗-HBs单克隆抗体(D12- McAb)制备亲和层析胶,对2A8细胞(分泌G145R变异HBsAg)培养上清盐析物进行亲和纯化。采用SDS-PAGE、Western blot及ELISA,对纯化产物的纯度、特异性、含量和回收率进行鉴定,并与同法纯化的HBsAg阳性血清及r-wHBsAg提取物进行比较。结果D12-McAb对重组真核表达G145R变异HBsAg、HBsAg阳性血清及r-wHBsAS三者具有相似的亲和性,产物纯度分别为90.3%、95.2%和93.1%,回收率分别为43.3%、72.0%和66.4%。结论已成功地建立了重组G145R变异HBsAg抗体亲和纯化方法,为G145R变异以及其他HBV免疫逃逸变异感染的深入研究奠定了重要的技术基础。
- 张波李方和龚劲松田拥军张春燕李时君陈妍黄永国杨东亮
- 关键词:乙型肝炎表面抗原单克隆抗体
- 热休克蛋白90抑制剂17-AAG对乙型肝炎病毒复制的抑制作用被引量:1
- 2012年
- 目的探讨热休克蛋白90(HSP90)是否参与肝细胞转化生长因子(TGF)β信号通路的活化,以及HSP90对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法 HSP90抑制剂17-AAG作用HepG2细胞,提取细胞总RNA,实时定量RT-PCR检测TGFβ下游信号分子PAI-1的表达。HepG2细胞用17-AAG预处理2 h,同时用TGFβ或TβR抑制剂SB431542作用后,将HBV复制型质粒HBV1.3转染细胞,第4 d提取HBV核心颗粒,Southern Blot检测HBV复制中间体,ELISA检测上清HBsAg的表达。结果 17-AAG能够下调HepG2细胞PAI-1的表达,HepG2细胞内HBV复制中间体表达水平明显降低,HBsAg的表达亦受到抑制,但上调或阻断TGFβ信号通路对HBV复制影响不明显。结论 HSP90参与肝细胞内TGFβ信号通路的活化,其抑制剂17-AAG能够抑制HBV的复制与蛋白表达,但该抑制作用与TGFβ信号通路活化无关。
- 柯晓煜王秋景余源刘慎沛张春燕陈妍杨燕杨东亮
- 关键词:转化生长因子Β
- 热休克蛋白90抑制乙型肝炎病毒复制的初步研究被引量:2
- 2012年
- 目的了解热休克蛋白90(HSP90)对HBV复制的影响并探讨其可能的分子机制。方法构建人HSP90真核表达质粒pXF3H-HSP90(HA—HSP90),与HBV复制型质粒HBV1.3共转HepG2细胞,ELISA检测细胞上清液HBsAg表达水平,Southemblot检测HBV复制中间体的表达。将HA—HSP90表达质粒或HSP90siRNA转染HepG2细胞,实时定量逆转录聚合酶链反应检测白细胞介素(IL)-1D、IL-6以及干扰素应答基因1(IFIT1)的表达。将TANK结合激酶1(TBK1)siRNA、HBV1.3、HA—HSP90共染HepG2细胞,Southemblot检测HBV复制中间体的表达。多组间数据比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验。结果成功构建了表达HSP90的真核表达质粒HA—HSP90。转染HA—HSP90的HepG2细胞内高水平表达外源蛋白,而未转染质粒的细胞内没有检测到外源蛋白的表达。转染HA-HSP90质粒组细胞上清液中的HBsAg表达量吸光度值为0.124±0.033,明显低于转染空载体pXF3H组的0.340±0.011及未转染组的0.615±0.069(F=61.013,P〈0.05)。过表达HSP90也能抑制HBV复制,转染HA-HSP90组、转染空载体pXF3H组与未转染组HBV复制中间体表达量吸光度值分别为108.92±8.59、872.45±13.00和7856.37±60.23,差异有统计学意义(F=28260.00,P〈0.05)。在HepG2细胞内高表达HSP90能诱导高水平的IFIT1产生,其中HA—HSP90组与空载体对照pXF3H组IFIT1表达的2 ^△△ CT值分别为82.139±0.919和5.579±0.644,差异有统计学意义(F=13.108,P〈0.05),但未检测到IL-1β与IL-6的诱导表达。下调HepG2细胞中干扰素信号通路分子TBK1不影响HSP90对HBV的抑制,其中HSP90组与siTBK1±HSP90组HBV复制中间体条带灰度值分别为1952.64±67.88和2366.64±71.16(F=31.30,P〉0.05)。结论HSP90能够抑制HBV的复制与蛋白表达,这种抑制作用不依赖于TBK1通路,也与IL-1β信号通路无关。
- 黄红平余源刘慎沛张春燕陈妍杨燕
- 关键词:热休克蛋白质类肝炎病毒乙型
- 市售HBsAg检测ELISA免疫逃逸变异检测能力的再评价被引量:1
- 2008年
- 目的考核现行市售ELISA试剂对野生及免疫逃逸变异HBsAg的检测能力。方法采用一组市售ELISA试剂对本室既往研制的高浓度与定值基因重组G145R变异HBsAg质控物,部颁血清HBsAgELISA检测质控物,多种乙肝病毒免疫逃逸变异重组S蛋白表达产物(细胞培养上清),以及一组经特殊选择的临床血清进行检测,并与既往有关检测资料进行比较。结果自制G145R变异HBsAg质控物与抗HBsG6mAb的结合能力较一年前降低40.7%,但仍保持留较为完好的免疫反应性。以此及部颁质控血清进行考核,10份市售试剂中6份对IEMHBsAg的检测能力与野生HBsAg相当(比较显色强度大于90.0%,相对应敏感指数大于0.5),3份试剂出现不同程度的降低(比较显色强度介于83.5%~50.7%,相对应敏感指数介于0.25~0.125),1份试剂仅表现出极弱的检测现象(比较显色强度为11.20%,相对应敏感指数0.0039)。采用ELISAI、J及L等试剂对一组临床标本进行检测,阳性率分别为6.23%、14.89%、19.21%,前者HBsAg检出率较后两者显著为低(P<0.05及0.01),后两者阳性率间亦表现出显著的差异(P<0.05)。结论现行国产试剂对IEMHBsAg检测能力较既往已大幅度提高,采用以单一G145R变异HBsAg制备的质控物仅能部分评价它们对IEMHBsAg的检测能力。
- 刘静华黄鹏张波彭静张春燕黄永国龚劲松陈妍李方和
- 关键词:ELISA乙肝病毒HBSAG