王晓娜
- 作品数：19 被引量：23H指数：3
- 供职机构：军事医学科学院微生物流行病研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学理学更多>>
- 离子交换高效液相色谱法分析质粒pUDKH被引量：6
- 2004年
- 采用阴离子交换高效液相色谱法监测重组质粒pUDKH的生产过程和该质粒产物中超螺旋pUDKH的比例。所用的色谱条件为:色谱柱TSKgelDNA NPR(4 6mmi d ×75mm);流动相体系由20mmol/LTris HCl(pH8 8)和1mol/LNaCl组成,梯度洗脱方式。分析结果表明:质粒产物中超螺旋pUDKH含量达95%(质量分数)以上时,检测不到残留的核糖核酸(RNA)。高效液相色谱法检测质粒pUDKH产物及其生产过程的灵敏度高、试样用量少,分辨率高。
- 刘佳张庆林毕建进王晓娜龚萍哈小琴王正平吴祖泽
- 关键词：肝细胞生长因子超螺旋生产过程
- 质粒pUDKH的高效液相色谱分析
- 本文对质粒pUDKH产品及其生产过程进行HPLC分析,各批超螺旋质粒pUDKH含量达到95﹪以上,该分析方法具有简单、快速、准确等优点.
- 刘佳张庆林毕建进龚萍王晓娜王正平吴祖泽
- 关键词：质粒高效液相色谱
- 文献传递
- 结核分枝杆菌16-kDa α晶体蛋白的原核表达及纯化
- 2012年
- 目的:利用基因工程技术原核表达并纯化结核分枝杆菌α晶体蛋白(Acr)。方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增Acr的编码基因,以pCold为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析和纯化该表达产物。结果:构建了具有正确基因序列的Acr重组表达质粒,重组Acr在大肠杆菌BL21(DE3)中经低温诱导得到可溶性表达;分别用6×His的单克隆抗体和16-kDa单克隆抗体对表达产物进行Western印迹分析,结果显示在相对分子质量约19 000处均有特异性条带,与预计大小吻合;纯化后蛋白纯度达90%,浓度达0.8 mg/mL。结论:表达了重组可溶性Acr,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。
- 王晓娜刘大斌安小平李存李建彬范华昊张文慧张博米志强童贻刚
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达纯化
- 抗禽流感病毒H5N1分泌型IgA在中国仓鼠卵巢细胞中的表达被引量：1
- 2011年
- 分泌型IgA(SIgA)在机体的粘膜免疫中具有重要作用,在外分泌道中比单体IgA和IgG抗体具有更好的抗感染活性。为了表达抗禽流感病毒H5N1人-鼠嵌合分泌型IgA抗体,首先以本室先前构建的稳定表达IgA的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞系为基础,共转染分泌片和J链表达质粒,然后用抗生素Zeocin选择阳性克隆细胞,利用倍比稀释的方法筛选分泌SIgA的单克隆细胞,通过Western blotting分析培养上清中SIgA的表达情况。结果表明,在CHO细胞中成功表达了SIgA抗体,上述研究为研制分泌型IgA抗体制剂奠定了良好的基础。
- 李存张宝中安小平米志强刘大斌姜焕焕潘博王盛陈斌黄芬王娟王晓娜童贻刚
- 关键词：WESTERNBLOTTING
- 从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体
- 2012年
- 目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白(alpha-crystallin Acr)的人源抗体。方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析。将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定。结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群。成功制备了可溶性单链抗体。Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合。结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础。
- 王晓娜米志强安小平李建彬范华昊张文慧张博黄勇周丽君童贻刚
- 关键词：ACR蛋白噬菌体抗体库单链抗体
- shRNA随机文库结合TK自杀基因筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子
- 2012年
- 构建shRNA随机文库与HIV-1 LTR启动胸苷激酶基因(TK基因)稳定表达的稳定细胞系HEK293/TK,将两者结合起来,筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子。方法:通过化学合成含有19个随机脱氧核苷酸的发夹结构,将其退火补平后与合成的接头Linker连接进行PCR反应,将PCR产物酶切后置于慢病毒载体pLenti-U6启动子下游由此构建shRNA随机文库;利用重叠PCR将HIV-1 LTR片段和TK基因连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系HEK293/TK;将所获得的文库质粒包装成慢病毒后侵染所构建的HEK293/TK细胞系,通过加入药物GCV进行加压筛选获得存活细胞。结果:成功筛选到加药后存活下来的细胞,抽提细胞基因组,采用巢式PCR扩增目的干扰序列并用Western blot对干扰序列进行验证,鉴定获得一个克隆所表达的shRNA能对TK基因的表达起到抑制作用,通过测序分析获得其干扰序列,该序列很有可能针对HIV-1 LTR某宿主相关因子。结论:成功构建了一种筛选HIV-1 LTR相关宿主因子的方法,筛选所得序列可以定位到具体相关宿主因子,为靶向筛选抗HIV-1药物提供了重要手段。
- 李建彬米志强安小平谭莉陈斌王晓娜范华昊张文慧张博方祥童贻刚
- 关键词：慢病毒载体
- 人免疫缺陷病毒假病毒药物筛选模型的构建及其应用被引量：1
- 2012年
- 目的:构建人免疫缺陷病毒(HIV)假病毒模型,用多种HIV逆转录酶和蛋白酶抑制剂作用于该模型,以检测其是否能有效用于HIV抑制药物的筛选。方法:通过载体改造获得最终慢病毒载体puc18-NL4-3-LUC-stop,其中含有萤光素酶基因,将该载体与包膜质粒VSV-G共转染293FT细胞,包装产生HIV假病毒,在假病毒包装和病毒感染293FT细胞的过程中加入蛋白酶和逆转录酶抑制剂,通过检测感染细胞中萤光素酶的表达来检测该模型的有效性,并利用此模型检测药物的抗病毒效果。结果:将HIV逆转录酶和蛋白酶抑制剂作用于该假病毒模型时发现萤光素酶的表达得到很大程度的抑制。结论:建立了HIV假病毒药物筛选模型,该模型以萤光素酶基因作为报告基因,快速灵敏,在抗HIV药物筛选中有一定的应用价值。
- 李建彬陈斌米志强安小平李存刘大斌王晓娜范华昊方祥童贻刚
- 关键词：人免疫缺陷病毒慢病毒载体假病毒药物筛选
- 反相高效液相色谱法分析聚乙二醇修饰的水蛭素被引量：1
- 2009年
- 目的:采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对聚乙二醇(PEG)修饰的水蛭素进行分析分离,用以分析修饰产物中不同修饰度水蛭素的组成和比例。方法:色谱柱为HypersilC18,5μm,4.6mm×150mm;流动相A为H2O+0.01%的三氟乙酸,流动相B为乙腈+0.01%的三氟乙酸。40min内由10%～50%流动相B进行梯度洗脱,洗脱流速1mL/min,上样量50μL,检测波长为214nm。结果:在单甲基化PEG-丙酸琥珀酰亚胺和水蛭素摩尔比不同的的反应产物中,PEG1-水蛭素、PEG2-水蛭素均可以达到基线分离,且不同批次的反应产物进行RP-HPLC的重复性良好。结论:RP-HPLC可以有效地对PEG修饰的水蛭素产物进行分析分离,为PEG化水蛭素的长效、缓释剂型的开发提供技术支持。
- 肖凤君王晓娜毕建进于爱平
- 关键词：反相高效液相色谱水蛭素聚乙二醇
- 用于大容量人源天然噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定被引量：5
- 2012年
- 目的构建一个应用于大容量Fab段天然噬菌体抗体库的表达载体。方法用定点突变技术将表面呈现噬菌粒载体pDF上的BssHⅡ酶切位点改为BglⅡ酶切位点,然后分别在抗体轻链和重链位置插入自杀基因SacB,构建含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB;利用抗乙肝表面抗原抗体的基因为模板,PCR扩增重链和轻链基因片段。将PCR扩增的轻链基因和重链基因分别插入载体pDF-D-SacB内,利用电转化的方法将其转入Trans1-Blue大肠杆菌,构建2个初级质粒,再利用初级质粒超感染BSl365菌,使其轻链与重链发生重组,获得重组质粒,进一步获得抗乙肝表面抗原抗体的噬菌体。之后利用该噬菌体感染大肠杆菌Trans1-Blue进行扩增,得到大量抗乙肝表面抗原的噬菌体抗体。最后,通过酶联免疫吸附剂测定检测所获得的抗体。结果通过向pDF重轻链区域插入SacB基因,改造抗体基因克隆位点,构建了pDF-D-SacB载体;经检测,pDF-D-SacB可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,可以在分泌Cre蛋白酶的细菌胞内发生预期的Cre-Loxp介导的定点重组。结论所获得的含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB适用于构建大容量噬菌体抗体库。
- 潘博付文卓王晓娜张宝中米志强安小平刘大斌李存姜焕焕陈斌童贻刚
- 关键词：噬菌体抗体库乙肝表面抗原
- 以HIV-1 5'LTR为靶点的药物筛选细胞模型的构建被引量：1
- 2011年
- 构建以人类免疫缺陷病毒(HIV-1)5'LTR为靶点的药物筛选细胞模型,用于体外筛选潜在的对HIV-1启动子具有抑制作用的药物,或用于筛选与HIV-1复制相关的宿主因子。通过PCR扩增HIV-1 5'LTR片段和胸苷激酶基因(thymidine kinase gene,TK基因),以这2片段为模板进行重叠PCR将两者连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系;加入药物更昔洛韦(GCV)检测TK基因的表达。成功构建了HIV-1 5'LTR调控TK基因表达的稳定细胞系,在其培养过程中加入药物更昔洛韦时,细胞逐渐死亡。构建了以HIV-1 5'LTR为靶点的药物筛选细胞模型,该模型利用TK基因作为报告基因方便灵敏,可用于筛选针对HIV-1 5'LTR的潜在抗HIV药物。
- 李建彬陈斌米志强安小平李存刘大斌王晓娜范华昊方祥童贻刚
- 关键词：HIVLTR药物筛选
