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犬黑皮质素受体3原核表达载体的构建与表达被引量：2: 2010年; 背景:近年黑皮质素受体家族在体内能量平衡中的作用越来越受到重视。黑皮质素受体3基因突变是引起体质量增加的重要因素之一,但是目前对黑皮质素受体3的深入研究很少,且未见在蛋白水平上检测其表达的单克隆抗体。目的:构建犬黑皮质素受体3基因编码区的原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达。方法:以Beagle犬基因组DNA为模板,设计特异性引物,经PCR技术扩增目的片段后,克隆到pMD18-T载体上,双酶切鉴定以后将目的基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coliDH5α,筛选阳性克隆,DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC3R转化到E.coliBL21内,经IPTG诱导后,利用Western blot检测犬黑皮质素受体3融合蛋白的表达。结果及结论:成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC3R,经DNA测序证实插入序列与Genebank上公布的序列一致。此重组体经诱导后能在E.coli BL21内表达犬黑皮质素受体3融合蛋白,为进一步获取犬黑皮质素受体3的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究犬黑皮质素受体3蛋白的结构和生理功能提供帮助。; 谢建中王光川巴彩凤; 关键词：PGEX-4T-1 质粒构建

UNC5C蛋白在大肠癌中的表达及其与预后的关系被引量：2: 2012年; 探讨大肠癌组织中UNC5C基因表达情况与大肠癌的分化、转移及临床预后的关系。采用免疫组织化学方法分析UNC5C蛋白的表达水平,以Kaplan-Meier生存曲线分析UNC5C与预后的关系。结果正常大肠组织中UNC5C的表达与大肠癌组织和腺瘤组织各组之间存在明显差异,并且大肠癌组织中UNC5C的表达与TNM分期有关。UNC5C阴性组与阳性组的生存率存在差异。因此得出结论,UNC5C蛋白表达可作为大肠癌病情发展及预后的标记物之一。; 武洁王光川陈学军; 关键词：大肠癌免疫组化预后

细胞凋亡率检测方法的探索被引量：9: 2015年; 目的探索可用于全面准确评价细胞凋亡率的检测技术。方法选取地塞米松诱导胸腺细胞凋亡模型,用流式细胞术及DNA琼脂糖凝胶电泳等方法对处于不同凋亡阶段的胸腺细胞凋亡率进行检测分析。结果流式细胞分析对于早期凋亡胸腺细胞的检测不仅具有高度灵敏性,而且可有效区分凋亡与坏死细胞,但对于凋亡晚期细胞膜严重受损乃至破碎的细胞,单纯流式细胞仪检测不能有效反映真实凋亡率;借助琼脂糖凝胶电泳法可检测破碎后释放到胸腺组织或培养基内的DNA碎片;当凋亡严重导致大量细胞破碎降解时,对样本进行细胞计数比较亦有重要参考价值。结论为全面和准确地评估细胞凋亡率,需选择多种检测方法结合分析,细胞学及寡核苷酸片段检测技术是一个相当不错的选择。; 郭茜茜于广吴丹丹苗苗佟伟王光川; 关键词：细胞凋亡率琼脂糖凝胶电泳法流式细胞术

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及表达被引量：3: 2008年; [目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。; 王光川巴彩凤苏荣健张轶博赵微宋慧娟武洁; 关键词：真核表达载体 MDCK细胞

肥胖MC4R重组腺病毒表达载体的构建及鉴定: 2011年; 目的构建黑素皮质素受体-4(MC4R)重组腺病毒表达载体,为肥胖症的基因治疗研究奠定基础。方法 PCR扩增犬MC4R目的基因后与T载体连接,双酶切鉴定正确的T-A载体获得具有黏性末端的MC4R目的基因;将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,构建穿梭载体pShuttle-CMV/MC4R;PmeⅠ单酶切pshuttle-CMV/犬MC4R后,转化到含pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,采用细菌内同源重组法构建腺病毒载体pAdeasy-1/pshuttle-CMV/MC4R;筛选阳性克隆子;PacⅠ酶切鉴定。结果线性化的pShuttle-CMV/MC4R转化含pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,16 h后获得阳性克隆子,经PacⅠ酶切鉴定出一大于20 kb的大片段和3.0 kb的特征性片段,通过BglⅡ、XhoⅠ双酶切切下约1000 bp的片段,含MC4R目的基因的重组腺病毒载体构建成功。结论细菌内同源重组法可高效、快捷的制备含犬MC4R的重组腺病毒载体;该载体为人类肥胖症的基因治疗研究奠定了基础。; 王玉彬吕金钢苏荣健王光川巴彩凤; 关键词：肥胖同源重组腺病毒载体

大肠癌组织中unc5c基因启动子甲基化的分析被引量：3: 2010年; 目的分析大肠癌(colorectal cancer,CRC)组织中unc5c基因启动子区域甲基化的改变状况及其临床意义。方法运用甲基化特异性PCR技术,检测73例大肠癌患者手术切除的癌组织和相应的癌旁组织及28例正常组织、36例腺瘤患者手术切除的腺瘤组织中unc5c基因启动子区域甲基化的改变情况,并分析与临床病理特征之间的关系。结果 73例癌组织样本中甲基化检出率为75%(55/73),相应的癌旁组织为7%(5/73),腺瘤组织为63%(23/36),而正常组织中未检出unc5c基因甲基化。unc5c基因甲基化检出率与年龄、分化程度及TNM分期有关。结论检测unc5c基因启动子区域异常甲基化是大肠癌早期辅助诊断的分子标志物之一。; 武洁陈学军薛占瑞王光川; 关键词：大肠癌甲基化甲基化特异性PCR

维生素C对热应激小鼠肝脏HSP70 mRNA及蛋白表达的影响被引量：11: 2011年; 目的通过对小鼠肝脏热休克蛋白70(HSP70)表达的实验研究,验证在夏季高温季节运输过程饮水中添加维生素C(VitC)对热应激缓解作用的可行性。方法昆明小鼠30只,随机分为3组,A组为常温对照组,B组为热应激组,C组为实验组(热应激+VitC组),B、C组在恒温箱内30℃饲养6 h,于实验后处死各组小鼠,取其肝脏组织,利用半定量法和Western blot蛋白印记技术检测HSP70的表达情况,做组间比较分析。结果 B、C组HSP70 mRNA和蛋白表达水平均高于对照组(P<0.01或P<0.05),且B组均高于C组(P均<0.05)。结论饮水中添加VitC使HSP70的表达趋于正常,对热应激有一定的缓解作用。; 韩喜彬谢建中巴彩凤王光川; 关键词：小鼠热休克蛋白质70 热应激维生素C

比格犬MC4R基因与肥胖的关系研究被引量：1: 2012年; [目的]探讨犬黑素皮质素受体-4(MC4R)基因与肥胖的关系。[方法]通过PCR-RFLP技术分析犬MC4R基因多态性与体重的关系。通过载体构建和细胞培养技术来构建犬MC4R基因的真核表达载体并转染MDCK细胞,研究该基因的体外表达情况。最后通过小鼠尾静脉高压注射重组真核表达载体的方法进行动物试验。[结果]比格犬226 bp C/A多态性与体重呈显著相关。犬MC4R基因在MDCK细胞内成功表达。MC4R重组体裸质粒注射后小鼠的体重有明显变化。[结论]MC4R基因能够促进小鼠的体重增加。该基因与肥胖的发生密切相关,将为肥胖机制的研究提供理论依据。; 王光川张轶博吕金钢巴彩凤; 关键词：MC4R 基因转染肥胖

犬MC4R突变体D90N真核表达载体的构建及表达被引量：2: 2010年; [目的]构建犬黑皮质素受体4(MC4R)突变体D90N真核表达载体,并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板,应用重叠PCR扩增MC4R突变体D90N目的基因,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N经酶切和测序鉴定;采用FuGENEHD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72.0h,提取细胞内总RNA,用RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,用WesternBlot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N重组真核表达载体,测序结果显示含有D90N突变位点。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N,重组体能在MD-CK细胞中表达。; 魏嘉王光川武洁张轶博宋慧娟巴彩凤; 关键词：真核表达载体 MDCK细胞

犬黑素皮质素受体-4裸质粒注射促进小鼠肥胖的研究被引量：1: 2009年; [目的]探讨犬黑素皮质素受体-4(MC4R)cDNA的重组真核表达质粒对小鼠肥胖的影响。[方法]3次尾静脉高压注射pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R质粒,RT-PCR成功验证小鼠体内犬MC4R表达后,适时监测每只小鼠的体重,同窝小鼠相互对照,利用两两比较的秩和检验进行统计学分析。另外,用脂肪组织病理切片分析小鼠皮下脂肪细胞变化。[结果]试验得出,小鼠体重变化有统计学意义;饲养时间相同、相互对照组的每一组小鼠脂肪细胞直径对比明显,且具有统计学意义。[结论]犬MC4R基因在小鼠体内表达,能促进小鼠体重增加,为犬MC4R调节肥胖机制的研究提供理论依据。; 吕金钢李久纯巴彩凤王光川苏荣健张轶博; 关键词：肥胖基因转染

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