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Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定被引量：8: 2010年; 目的利用毕赤酵母真核系统表达Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区（DENV-1—4 ED Ⅲ），获得可分泌表达的重组蛋白ED Ⅲ。方法PCR分别扩增Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ区基因，构建至pPIC9K毕赤酵母表达质粒。酶切线性化后电转化毕赤酵母菌GS115，涂板后经G418梯度浓度筛选，获得多株抗G4184．0mg／ml的高拷贝菌株，扩大培养后，利用甲醇诱导分泌表达重组蛋白，表达上清用Ni—NTA亲和树脂纯化后以免疫印迹鉴定。结果成功构建pPIC9K—DENV-1～4 ED Ⅲ重组质粒，高拷贝菌株经甲醇诱导后分泌表达Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ重组蛋白，纯化后获得的可溶性重组蛋白经变性凝胶电泳，相对分子质量约为12×10^3，与实际相符。免疫印迹鉴定结果表明该重组蛋白能与抗His单抗和抗Ⅰ～Ⅳ型DENV小鼠血清特异结合。结论成功通过毕赤酵母高效分泌表达I～Ⅳ型DENV EDⅢ蛋白，这些重组蛋白可进一步用于疫苗、诊断试剂和E蛋白生物学功能的研究。; 蔡建飘钱菲王嘉颖赵莹徐晓晶金维荣车小燕; 关键词：登革热病毒毕赤酵母基因表达调控病毒

白假丝酵母菌Csa2特异性抗体捕获ELISA的建立及初步评价: 目的建立白白假丝酵母菌Csa2特异性抗体的检测方法，并评价其在假丝酵母菌尿路感染中的应用。方法对Csa2蛋白标记辣根过氧化物酶，建立双抗原夹心ELISA法;以Csa2蛋白为包被蛋白建立间接ELISA法;联合早期建立的...; 刘玲丽蔡建飘刘彩怡郭勇晖潘玉先王艳芳富宁; 关键词：白假丝酵母菌 ELISA 抗体检测

免疫蛋白质组技术小鼠血清样品处理方法的比较分析: 2010年; 目的:建立适用于侵袭性真菌感染免疫蛋白质组学研究的小鼠血清样品处理方法。方法:用白蛋白和IgG去除试剂盒及CLEANUP试剂盒处理血清,比较处理与未经处理样品的二维凝胶电泳图谱,以及ECL显色图谱的差异。并对该处理方法的稳定性和重复性进行初步评价。结果:用白蛋白和IgG去除试剂盒及CLEANUP试剂盒处理小鼠血清样品的二维凝胶电泳图谱有更好的分辨率,其ECL显色图有更高的特异性和敏感性。且该处理方法重复性较好。结论:建立稳定的侵袭性真菌感染小鼠血清样品的处理方法,为进一步开展基于双向电泳的免疫蛋白质组学研究奠定了基础。; 江凌晓蔡建飘郝卫潘玉先王艳芳车小燕; 关键词：小鼠血清

双抗原夹心ELISA法检测马尔尼菲青霉Mp1p抗体被引量：10: 2013年; 目的建立一种检测马尔尼菲青霉特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。方法利用毕赤酵母系统表达重组马尔尼菲青霉特异性甘露糖蛋白Mp1p,并利用改良过碘酸钠法标记Mp1p,经棋盘滴定法建立一种可检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,并检测100例健康人群对照血清、21例血培养确诊其他真菌感染病人血清和15例血培养确诊马尔尼菲青霉病人血清,联合本实验室前期建立的马尔尼菲青霉抗原检测方法评价其临床应用价值。结果成功建立一种检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,经健康人群对照及其他真菌感染病人血清评价特异度为100%(121/121),检测15例马尔尼菲青霉病人血清,Mp1p特异性抗体2例阳性,Mp1p特异性抗原12例阳性,Mp1p抗体与抗原联合检测可明显提高灵敏度,达到93.3%(14/15)。结论双抗原夹心ELISA法检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体具有高度的特异性,联合抗原检测可提高马尔尼菲青霉感染诊断率。; 王艳芳曾磊陈学东郝卫杨梅蔡建飘王压娣袁国勇车小燕; 关键词：马尔尼菲青霉真菌抗体检测

白念珠菌感染特异性Csa2蛋白双抗体夹心ELISA体系的建立与评价被引量：1: 2014年; 目的以白念珠菌Csa2蛋白为靶标,建立双抗体夹心ELISA检测体系,评价该方法的检测灵敏度和特异性。方法构建pPIC9K-Csa2重组表达载体,电转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达、纯化重组蛋白rCsa2。rCsa2蛋白分别免疫新西兰大白兔和豚鼠制备免疫血清。以纯化兔多抗和豚鼠抗血清配对,利用棋盘滴定法,确定最佳实验条件,建立双抗体夹心ELISA检测系统。检测rCsa2和白念珠菌不同培养时间的上清,确定检测方法的灵敏度;检测其他3种念珠菌、5种曲霉、新型隐球菌和马尔尼菲青霉的培养上清,评价检测方法的特异性。结果成功构建表达载体并获得真核表达重组蛋白rCsa2,经SDS-PAGE鉴定相对分子质量(Mr)为13 300,符合预期值;Western blot法证实该蛋白可与特异性抗体结合。免疫动物获得高效价免疫血清,并以此成功建立双抗体夹心ELISA,可检测rCsa2蛋白的灵敏度约为240 pg/mL,并最早可检测到培养18 h的白念珠菌培养上清,与其他10种临床常见真菌的培养上清无交叉反应。结论建立了有较高的检测灵敏度和特异性的Csa2的双抗体夹心ELISA,为区别诊断白念珠菌感染提供新的方法。; 刘玲丽蔡建飘刘彩怡郭勇晖潘玉先王艳芳车小燕; 关键词：白念珠菌双抗体夹心ELISA

侵袭性曲霉感染特异性抗体的筛选及其初步临床应用研究被引量：3: 2010年; 目的筛选出可用于侵袭性曲霉感染实验室早期诊断的特异性单克隆抗体.方法应用单克隆抗体技术制备针对不同曲霉抗原的特异性抗曲霉单克隆抗体,根据单抗识别表位不同,初步筛选出两组灵敏度高、特异性强的单抗组合,并分别建立了双抗体夹心ELISA检测法.通过检测常见临床和环境分离曲霉株、马尔尼菲青霉及念珠菌培养液,感染动物模型标本,临床标本,初步评估检测方法的敏感性和特异性.并应用WB对抗体所识别靶标进行初步鉴定.结果获得32株稳定分泌曲霉单抗的杂交瘤细胞株,建立了2种双抗体夹心ELISA法,第1种方法可识别环境和临床分离的19种曲霉.第2种方法仅特异性识别临床和环境分离的烟曲霉,与其他曲霉抗原无交叉.对同一种烟曲霉培养液而言,第1种方法可检测稀释度为第2种方法的10倍.WB分析显示该组单抗识别的靶标为相对分子质量在25 000～75 000之间的甘露聚糖蛋白.结论本研究获得了可用于侵袭性曲霉感染实验室诊断的特异性单克隆抗体,单抗识别的抗原为相对分子质量在25 000～75 000之间的甘露聚糖蛋白.该抗原是侵袭性曲霉感染早期诊断的潜在标志物.; 江凌晓王艳芳郝卫丘立文蔡建飘潘玉先陈文霞姜长宏林丽娟车小燕; 关键词：曲霉标志物

双抗原夹心ELISA法检测烟曲霉Afmp1cr/Afmp2cr抗体被引量：3: 2014年; 目的建立检测烟曲霉特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。方法用毕赤酵母系统表达重组的烟曲霉特异性甘露聚糖蛋白片段Afmp1cr和Afmp2cr,经棋盘滴定法建立可检测烟曲霉特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。用Afmp1cr和Afmp2cr分别免疫兔血清评估方法灵敏度,健康人血清、其它微生物感染者血清评估特异性,并检测曲霉感染者血清。结果 Afmp1cr双抗原夹心ELISA法可捕获1∶800稀释兔多抗血清中的抗体,Afmp2cr双抗原夹心ELISA法可捕获1∶3200稀释兔多抗血清中的抗体,两者均与其他真菌及细菌无交叉反应。2例确诊曲霉感染和1例拟诊曲霉感染患者血清中能检测出抗体。结论初步建立了检测anti-Afmp1cr/Afmp2cr抗体的双抗原夹心ELISA方法,可辅助诊断临床烟曲霉感染。; 杨梅王卓娅郝卫王艳芳黄莉蔡建飘江凌晓车小燕钟晓祝余楠; 关键词：烟曲霉双抗原夹心 ELISA法抗体检测

白念珠菌Csa2蛋白双抗原夹心ELISA方法的建立及诊断价值被引量：2: 2019年; 目的建立以白念珠菌Csa2蛋白抗体为靶标的双抗原夹心ELISA,初步评价其鉴别诊断白念珠菌尿道感染的应用价值。方法通过间接免疫荧光染色定位Csa2蛋白在白念珠菌菌体分布情况;应用棋盘滴度法优化反应条件,建立双抗原夹心ELISA并进行方法学评价;检测324例健康体检者血清,确定该方法的cutoff值;检测120例健康体检者及30例念珠菌属尿路感染患者血清,分析其诊断的灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值。结果 Csa2蛋白是一种特异性分布在白念珠菌菌丝态表面的蛋白;以0.1 μg/mL的rCsa2蛋白为包被抗原,1∶1 000稀释的rCsa2-HRP蛋白为检测抗原,建立双抗原夹心ELISA,可最低检测1∶16 000稀释的rCsa2蛋白免疫兔血清并不与正常兔血清发生反应;该方法的cutoff值为0.072,诊断白念珠菌尿路感染敏感性为65.2%(15/23),特异性为98.4%(125/127),阳性预测值88.2%(15/17),阴性预测值为94.0%(125/133)。结论成功建立检测白念珠菌特异性Csa2蛋白抗体双抗原夹心ELISA;初步评价该方法对诊断白念珠菌尿路感染具有较高的特异性,得出较高阳性预测值和阴性预测值;Csa2抗体靶标对区分白念珠菌感染和定植具有一定价值。; 刘玲丽蔡建飘郭勇晖王艳芳车小燕; 关键词：白念珠菌

非结构蛋白1抗原捕获酶联免疫吸附法评价登革病毒抗体中和活性被引量：4: 2009年; 目的在获得具有中和活性的针对Ⅰ型登革病毒（dengue virus serotype Ⅰ，DENV-1）的抗体基础上，评价已建立的非结构蛋白Ⅰ（nonstructural protein 1，NS1）抗原捕获酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）分析抗体中和活性的可行性，为中和抗体的筛选和疫苗效果的评价提供一个更为快速、简便的检测方法。方法使用重组DENV-1包膜蛋白Ⅲ区（envelope protein domain Ⅲ，EDⅢ）免疫5只BALB／c小鼠制备单克隆抗体（简称单抗），采用间接ELISA、间接免疫荧光法（immunofluorescence assay，IFA）和免疫印迹法（Western Blot）对单抗进行筛选及鉴定；同时用该重组蛋白免疫1只新西兰兔，制备多克隆抗体血清；以传统噬斑减少中和试验（plaque reduction neutralization test，PRNT）作为参比方法，采用NS1抗原捕获ELISA对所获抗体进行中和活性检测。结果获得4株针对DENV-1 EDⅢ单抗和1份兔多抗血清，且被PRNT试验证明均具有中和活性，四株单抗腹水（1A1、1B3、3D3、9D6）和兔多抗血清中和效价分别为1：1024、1：512、1：256、1：4096和1：4096。使用NS1抗原捕获EHSA法检测不到PRNT中和效价最低的3D3抗体对DENV-1有中和能力，而检测其余3株单抗（1A1、1B3、9D6）和多抗兔血清中和效价均远低于PRNT测定结果，分别为1：32、1：32、1：128和1：128。结论简单、快速的NS1抗原捕获ELISA可用于评价DENV抗体的中和活性，该方法适合于高效价中和抗体的筛选，有望成为评价疫苗效果的方法之一。; 温坤丁彦青丘立文潘玉先蔡建飘岳彩峰狄飚车小燕; 关键词：登革热病毒病毒包膜蛋白质类酶联免疫吸附测定病毒非结构蛋白质类

登革病毒包膜蛋白Ⅲ区IgG抗体捕获酶联免疫吸附试验的建立及应用被引量：1: 2013年; 【摘要】目的建立一种高度敏感和特异的登革病毒（denguevirus，DENV）包膜蛋白Ⅲ区（envelopeproteindomain1]I，EDm）IgG抗体的检测方法，并探索这种方法在登革热诊断和血清流行病学调查中的应用价值。方法以毕赤酵母表达系统制备的重组全长DENVEDm作为抗原，建立DENVEDmIgG抗体捕获ELISA。用这种方法检测来自同一组35例DENV一1初次感染患者在2006年发病期和2010年随访期的血清标本，并将其检测的敏感性与商品化的PanbioDENVIgG抗体捕获ELISA试剂盒进行对比。结果DENVEDHIIgGELISA试剂盒对发病期和随访期血清标本检测的灵敏度分别是87％（20／23）和94％（33／35），而Panbio DENV IgGELISA试剂盒对这两个时期血清标本检测的灵敏度分别是71％（25／35）和0。DENV EDⅢ IgG ELISA试剂盒对两个时期血清检测灵敏度差异无统计学意义（X^2=0．946，P=0．331）。对于发病期血清标本，DENVEDⅢIgG ELISA试剂盒与Panbio DENV IgG ELISA试剂盒检测的灵敏度比较，差异无统计学意义（X^2=1．924，P=0．165）；而对随访期血清标本，DENV EDⅢ IgG ELISA试剂盒检测灵敏度高于Panbio DENV IgG ELISA试剂盒，差异有统计学意义（X^2=62．432，P=0．000）。结论DENVEDⅢIgG抗体捕获ELISA试剂盒对登革热患者发病期血清及随访期血清中IgG抗体的检测均具有高度的敏感性，有可能成为DF诊断和血清流行病学调查的有效工具。; 胡冬梅蔡建飘王大虎狄飚丘立文王压娣陈月丁细霞车小燕; 关键词：登革热病毒免疫球蛋白G 血清学试验

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