张玥
- 作品数：15 被引量：17H指数：2
- 供职机构：上海交通大学医学院附属瑞金医院更多>>
- 发文基金：上海市科委重大科技攻关项目上海市科学技术委员会基础研究重点项目国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 外周血白细胞中人巨细胞病毒pp65抗原的定位及意义被引量：1
- 2008年
- 目的明确人巨细胞病毒(HCMV)磷酸基质蛋白65(pp65)抗原在阳性细胞中的定位并初探其定位与病毒活动间的关系,为指导临床病毒抗原血症的监测提供依据。方法利用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染料能与细胞双链DNA结合的特点,在激光共聚焦显微镜下对HCMV pp65单抗阳染细胞进行抗原定位;同时通过外周血白细胞与病毒共培养技术,检测分析其定位与病毒活动的关系。结果临床标本检测的HCM- Vpp65抗原阳染细胞的表现形式有3种,即细胞浆型、细胞核型和细胞浆核混合型,其中细胞核中的HCMV pp65抗原聚集于细胞核的内部,而非仅仅附着于核表面。进一步的白细胞与病毒共培养结果显示,只有野生型病毒株感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)与外周血白细胞共培养,才能检出HCMV pp65抗原阳性的白细胞,而且表现为仅初期(培养1 h内)可检出细胞浆阳染型,随着时间延长,约80%～90%的抗原阳染白细胞表现为细胞核型,偶见细胞浆核混合型。结论HCMV pp65抗原血症时阳染的外周血白细胞的表现形式有3种,即细胞核型、细胞浆型以及细胞浆核混合型,其中细胞核型属细胞核内部型,并非细胞核表面附着型。结合共培养结果认为,细胞核型阳染细胞的检出更能提示病毒的活动。
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- 关键词：人巨细胞病毒共聚焦显微镜白细胞外周血
- 不同核酸提取法对HCMV-DNA准确定量的影响被引量：2
- 2006年
- 目的评价不同核酸提取法对人巨细胞病毒核酸(HCMV-DNA)荧光定量PCR准确定量的影响。方法含HCMVAD169株病毒颗粒的病毒培养物,以不同浓度分别与10份健康人HCMV-DNA阴性血浆标本混合;另取15份临床移植患者HC-MVpp65抗原血症阳性血浆样本,上述2种标本分别用碱裂解吸附法、沉淀煮沸裂解法和酚-氯仿抽提法提取病毒核酸模板,随后运用荧光定量聚合酶链反应对样本进行定量分析,并作评价。结果15例临床检测阳性血浆标本中,酚-氯仿法提取效率为最高(P<0.05),换算后其相对提取效率为100%,而沉淀煮沸裂解法为90%,碱裂解吸附法为65%;此外,沉淀煮沸裂解法和酚-氯仿法的重复性均好于碱裂解吸附法,变异系数(CV)值分别为0.26、0.30和0.39。结论经典、传统的酚-氯仿抽提法仍不失为实验室首选的核酸提取方法。
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- 关键词：核酸荧光定量PCR人巨细胞病毒
- 人巨细胞病毒UL97基因耐药重组株的构建与鉴定
- 2009年
- 目的构建含UL97基因耐药相关突变的重组人巨细胞病毒（rHCMV），并通过耐药表型和基因型加以鉴定。方法采用重叠延伸剪接PCR在UL97基因中引入PineI位点和耐药相关位点做定点突变，将所获突变基因片段按比例与人巨细胞病毒（HCMV）AD169标准株DNA混合，经脂质体介导共转染成纤维细胞MRC-5。利用间接免疫荧光检测HCMVPP65抗原，证实MRC-5已被rHCMV感染，观察同源重组病毒形成的细胞病变达100％后收获该重组病毒。用不同浓度更昔洛韦进行噬斑筛选纯化目的病毒，并通过噬斑减少试验和耐药基因（UL97和UL54）序列分析对重组病毒进行鉴定。结果成功构建目的突变UL97基因片段，同病毒基因组DNA共转染7d后可见明显细胞病变，PP65抗原检测证实为rHCMV感染灶。经过克隆筛选得到的重组病毒株UL97基因型分析结果与预期一致，UL54基因测序未发现突变。阳性克隆重组病毒对更昔洛韦敏感性显示半数抑制浓度（IC50）为15μmol／L，是标准株的12倍，具耐药表型。结论成功将HCMV基因组DNA与耐药突变目的基因片段共转染MRC-5细胞，通过更昔洛韦筛选和噬斑纯化获得目的重组病毒株。该方法的建立为在用药过程中不断出现的新的HCMV耐药突变株的鉴定分析提供了有效的技术平台。
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- 关键词：巨细胞病毒病毒点突变病毒转染
- 三株抗人巨细胞病毒pp65蛋白单克隆抗体的鉴定和应用被引量：3
- 2007年
- 目的 制备抗HCMVpp65蛋白的单克隆抗体（简称单抗），并对其进行相关研究。方法 以重组表达的HCMVpp65蛋白为抗原，运用杂交瘤技术制备单抗，对获得的单抗进行Ig亚型、特异性、效价和亲和常数的鉴定与测定，并以免疫荧光检测法与进口同类产品进行比较。结果 获得3株针对HCMVpp65蛋白的单抗，即B6、G12、2812；Ig亚型依次为IgG1κ型、IgG1κ型、IgMg型；亲和常数依次为3．6×10^7L／mol、3．8×10^7L／mol、3．1×10^7L／mol；免疫印迹试验结果表明，3株单抗都与HCMVpp65蛋白特异性的结合，除2B12外，B6、G12与EB病毒（EBV）、单纯疱疹病毒（HSV）Ⅰ、HSVⅡ均无交叉反应；与进口单抗平行检测140份临床标本，结果一致（r=1．00，P〉0．05）。结论 成功获得3株稳定分泌抗HCMVpp65蛋白的杂交瘤细胞株，所产生的抗体特异性和亲和力较理想，为HCMVpp65蛋白抗原血症检测国产化试剂盒的研制奠定了基础。
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- 关键词：巨细胞病毒PP65蛋白
- 人巨细胞病毒耐药相关蛋白PUL97局部结构模拟和突变分析
- 2010年
- 目的初步探索人巨细胞病毒耐药相关蛋白PUL97局部序列(329～572aa)的三维模拟结构并进行突变的耐药分析。方法采用巢式PCR方法扩增UL97基因776 bp片段并测序,以此发现非同义突变;然后利用SWISS-MODEL结构模拟综合服务器和其他相关软件比对模式对野生型PUL97蛋白片段进行同源模建并优化,通过各种指标或服务器来评估模拟结构的优劣并作筛选。将筛选所得的最佳模拟结构用于非同义新突变型的初步耐药分析。结果最终筛选出的模拟结构是以1YDTE为模板,以L1.FASTA为比对文件所得的Model A。整个分子的能量最低,ProQ的预测分数最高。分子对接分析也发现了潜在的ATP和GCV结合口袋。利用已知的阴阳性耐药点突变验证了该结构的合理性。同时根据突变前后结构信息的改变,提示C518Y单点突变以及联合突变(E517G和C518Y)呈现高度可疑的耐药特性。结论 PUL97野生型蛋白计算机结构模拟和突变分析法是初步评估新突变型耐药特性的又一方便快捷的方法 ,可用于实验验证前的筛选;但模拟结构本身的准确性是成功运用该方法的前提。
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- 关键词：人巨细胞病毒突变分析
- 人巨细胞病毒pp65核酸疫苗的构建、表达与动物免疫效应被引量：1
- 2005年
- 构建真核重组表达质粒PVAX1-pp65,通过对其表达产物的鉴定和免疫小鼠实验,探讨PVAX1-pp65载体对诱导免疫应答的效果及方式。用已构建的原核表达载体pp65-pet32a,经酶切后与DNA疫苗载体PVAX1连接,构建HCMVpp65核酸疫苗(PVAX1-pp65)。用脂质体法将其转染293细胞,经间接免疫荧光、免疫印迹试验来验证其表达的产物。同时,免疫小鼠后取其脾脏细胞,经流式细胞仪检测其CD4+和CD8+T细胞;并利用MTT法测定免疫小鼠的T细胞对ConA和重组pp65蛋白刺激后的增殖活性。结果显示构建的真核表达载体PVAX1-pp65,经测序验证其序列正确。体外转染实验结果表明转染重组质粒的细胞胞浆内呈现与特异性pp65单克隆抗体反应的颗粒状荧光产物,免疫印迹试验也显示重组质粒转染的细胞裂解物中有pp65蛋白条带。另外,免疫小鼠脾CD8+T细胞的含量明显高于对照组;免疫鼠脾细胞对重组pp65抗原蛋白的刺激后增殖反应明显。综上结果证实,成功地构建了HCMVpp65核酸疫苗,并能有效地表达,表达的蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。HCMVpp65DNA疫苗可诱导小鼠产生针对HCMV的特异性细胞免疫应答,可作为一种有应用前景的核酸疫苗进一步深入研究。
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- 关键词：人巨细胞病毒PP65核酸疫苗细胞免疫
- 白假丝酵母临床分离株基因分型与药敏分析被引量：4
- 2006年
- 目的分析上海交通大学医学院附属瑞金医院白假丝酵母的基因分型情况以及不同基因型白假丝酵母的药敏结果。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增白假丝酵母25S核糖体DNA基因的内含子区,可转座Ⅰ型内含子插入片段的数目及大小的不同使得扩增产物不同,根据产物片段大小和数目分型。采用微量稀释法分析白假丝酵母抗真菌药物敏感性。结果171株白假丝酵母分为3型:A型93株,B型47株,C型31株。B型、C型白假丝酵母对唑类抗真菌药物的耐药率显著高于A型菌株,对氟胞嘧啶的耐药率低于A型菌株。结论白假丝酵母的PCR分型方法简便、快速、重复性好、特异性强;不同型别的白假丝酵母耐药谱有差异,对治疗中抗真菌药物的选择有一定的指导意义。
- 彭奕冰季育华张玥倪语星
- 关键词：白假丝酵母基因分型药敏分析
- 人巨细胞病毒在免疫力低下人群中耐药研究新进展被引量：1
- 2009年
- 章莉张玥季育华
- 关键词：人巨细胞病毒更昔洛韦耐药
- 人巨细胞病毒对更昔洛韦耐受性的基因型鉴别方法的建立和应用被引量：1
- 2009年
- 目的建立实验室检测人巨细胞病毒(HCMV)更昔洛韦(GCV)耐药的基因型分析的常规方法。方法采用巢式聚合酶链反应(PCR)直接扩增33例HCMV感染患者的外周血白细胞及前期实验同步获得的33例临床分离毒株的HCMV UL97基因片段,对扩增产物进行测序,与HCMV标准毒株AD169序列比对,参照国外报道的耐药相关的热点突变,判定各临床分离毒株的耐药基因型。结果除有1株为HCMV UL97呈M460V突变型外,余32株同标准株AD169的序列一致。同一患者的分离毒株与外周血白细胞中测得HCMV UL97基因序列完全一致。结论建立的实验室检测HCMV耐药的基因型分析完全可以替代传统的耐药表型分析,前者无需分离活病毒,不仅需时短,而且相对安全,其技术要点更适宜临床推广应用。
- 曹国君章莉华丽张玥方风琴季育华
- 关键词：人巨细胞病毒更昔洛韦耐药基因型
- 人巨细胞病毒临床分离株对更昔洛韦耐药的表型分析被引量：2
- 2009年
- 目的检测分析人巨细胞病毒(HCMV)临床分离株的更昔洛韦(GCV)耐药表型。方法收集临床接受GCV治疗过的各类移植受体的血液或尿液标本以及婴幼儿HCMV感染症患儿的尿液标本,分离HCMV。然后通过噬斑减少试验测试其对GCV药物的耐受性。病毒株对GCV的耐受性程度表示以不加药物孔中病毒致细胞病变效应(CPE)为参照,能够抑制50%CPE的药物浓度(IC50)为GCV的耐受性。GCV敏感型毒株的IC50为≤5.000μmol/L。结果以标本接种人胚肺成纤维细胞(MRC-5),最终获得病毒株共33株。其中6株来自移植受体,27株来自婴幼儿HCMV感染症患儿。以MRC-5为敏感细胞,调整所测病毒浓度为100×50%组织培养感染量(TCID50),并加入不同浓度的GCV药物,检测发现32株GCV的IC50均≤5.000μmol/L(1.500～5.000μmol/L),只有1株GCV IC50为12.500μmol/L。同步平行检测的标准毒株HCMV AD169的GCV IC50为1.500μmol/L。结论药物耐受表型测定能够了解并评估病毒对GCV药物的敏感与否,但全过程周期较长,技术要求比较高,尤其必须以获得活病毒为前提,尚难以直接推向临床实验室。
- 章莉张玥方风琴华丽邱定忠季育华
- 关键词：人巨细胞病毒更昔洛韦表型药物敏感性
