孙丹丹
- 作品数：13 被引量：19H指数：3
- 供职机构：军事医学科学院军事兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划吉林省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- HIV-1 B亚型假病毒的制备与鉴定被引量：1
- 2014年
- 目的制备携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和ENV包膜蛋白的HIV-1 B亚型假病毒用于感染研究,并建立可行的鉴定方法。方法双质粒共转染HEK293T细胞后收获病毒上清,TRIzol法提取病毒基因组并采用RT-PCR进行报告基因扩增,Western印迹和ELISA法检测病毒P24抗原。假病毒感染HIV-1允许细胞,进行报告基因检测、病毒滴度测定以及单轮感染活性实验研究。结果与结论建立了HIV-1假病毒制备与鉴定方法,制备获得了B型HIV-1假病毒,经鉴定具备感染SupT1和TZM-bl细胞能力,为HIV-1与宿主细胞相互作用研究奠定了基础。
- 王茂鹏李昌杜寿文朱羿龙朱娜孙丹丹金宁一
- 关键词：HIV-1
- 双特异性抗肿瘤重组腺病毒对前列腺癌细胞的抑制作用
- 2012年
- 目的探讨结合肿瘤特异性启动子hTERTp和特异性抑癌基因Apoptin的腺病毒Ad—hTERTp—Ela—Apoptin（Ad—VT）对前列腺癌PC-3细胞的抑制作用。方法于96孔板内制备前列腺癌PC一3单层细胞（5×10^3个／孔），分别用100个感染复数（multiplicityofinfection，MOI）、10MOI和1MOI的重组腺病毒Ad—VT、Ad—CMV—Apoptin（Ad—VP3）、Ad—hTERTp—E1a—EGFP（Ad．GT）和Ad—CMV．EGFP（Ad—EGFP）进行感染，以未感染孔为对照，每个剂量设3个复孔。采用96h噻唑盐（MTT）法，检测重组腺病毒埘PC-3细胞的抑制作用。于6孔板制备PC-3单层细胞（1×10^6个／孔），分别用100MOI的Ad—VT、Ad—VP3、Ad-GT和Ad—EGFP感染PC-3细胞，培养48h后，分别应用AO／EB染色法、DAPI染色法、AnnexinV检测法对PC-3细胞进行染色，在显微镜下观察细胞形态，分析Ad-VT对PC-3细胞的抑制方式；应用Caspase榆测法对PC-3细胞提取总蛋白，检测Caspase酶活性，分析Ad-VT对PC-3细胞的抑制方式。结果MTT法结果显示除Ad．EGFP外，Ad—VT、Ad—VP3和Ad—GT均不同程度地表现出对PC-3细胞的抑制作用，其中Ad—VT、Ad—GT的抑制作用强于Ad—VP3，差异有统计学意义（P〈0．05）；培养48、72、96h，随着MOI的增高，Ad—VT对PC-3细胞的抑制作用具有一定剂量效应关系趋势，感染剂量为100MOI时，Ad．VT对PC-3细胞的抑制作用具有一定时间效应关系趋势。通过AO／EB、DAPI、AnnexinV检测法和Caspase酶活性检测结果显示，Ad—VT可通过诱导PC-3细胞的捌亡抑制PC-3细胞的增殖。其中AO／EB染色可观测到经Ad—VT感染的PC-3细胞呈现橘红色；DAPI染色可观测到经Ad—VT感染的PC-3细胞细胞核呈现亮蓝色，且存在核内物质碎裂；AnnexinV检测法可观测到经Ad—VT感染的PC．3细胞出现磷脂膜外翻、细胞核皱缩、细胞膜通透性增加等凋亡特征；Caspase检测结果显示Ad—VT可明显上调Caspase2、3、6、8�
- 王金辉张慕淳李霄齐延新刘广臣孙丹丹金宁一
- 关键词：前列腺癌凋亡素重组腺病毒凋亡
- 新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证被引量：1
- 2011年
- 目的:构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体pVAX2,并对其功能进行验证。方法:设计一个包含人巨细胞病毒启动子(CMVpromoter)、T7启动子、信号肽基因、血凝素A表位基因(HA)、多克隆位点区域(MCS)、c-myc抗原表位、血小板来源的生长因子受体跨膜区域(PDGFR TM)及牛生长激素多腺苷酸化信号(BGHpolyA)等八种元素的表达盒Ⅱ(Expressing cassetteⅡ),在其上下游添加NruⅠ酶切位点后,进行人工化学合成,连接到克隆载体pGH中得pGH-Ⅱ;用NruⅠ酶切pGH-Ⅱ,回收1 300bp左右的片段,去磷后插入到pVAX1的相应位点,NruⅠ及BglⅡ/PstⅠ酶切鉴定,获得新型基因疫苗真核表达载体pVAX2;然后以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,将其分别构建至两个不同的表达盒内,脂质体转染BHK-21细胞,利用RT-PCR及荧光显微镜技术进行该载体的功能验证。结果:两个表达盒内的EGFP基因在BHK-21细胞均能高效表达,相互间不受影响,且新构建的表达盒具有蛋白展示功能。结论:成功构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体pVAX2,为多价DNA疫苗的研究奠定了坚实基础。
- 杜寿文李昌王宇航任大勇刘存霞孙丹丹朱娜李沂秦艳青金宁一
- 关键词：EGFP
- 新型三基因表达盒痘苗病毒转移载体的构建及评价
- 引言/目的痘苗病毒天坛株自身具有广阔的克隆空间、广泛的宿主和细胞范围、可形成稳定的重组体等作为载体的优越性,还具有相对毒力较弱、比较安全等特点,因此广泛用于生物医药研究与开发。本研究本着提升临床应用安全性、外源基因高效表...
- 杜寿文李昌王宇航刘存霞任大勇孙丹丹朱娜李沂秦艳青金宁一
- 文献传递
- 携带抗口蹄疫病毒ScFv基因猪成纤维细胞系的建立
- 2012年
- 根据口蹄疫病毒的感染特征及其在临床发病过程中呈现的症状,筛选抗口蹄疫病毒单链抗体基因。通过EcoRⅠ/NotⅠ双酶切中间质粒pGEX-ScFv获得单链抗体基因片段,并克隆至反转录病毒载体质粒pFB-neo,构建反转录病毒穿梭载体质粒pFB-ScFv。将pFB-ScFv与辅助质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK293T细胞,包装重组反转录病毒MMLV-ScFv。同时,构建含增强型绿色荧光蛋白基因的重组反转录病毒MMLV-EGFP作为对照。利用所包装重组反转录病毒感染猪成纤维细胞,通过G418筛选获得携带目的基因的单克隆细胞集落。试验结果表明,本试验在成功构建反转录病毒穿梭载体pFB-ScFv和pFB-EGFP的基础上,获得了分别携带抗口蹄疫病毒单链抗体基因和增强型绿色荧光蛋白基因的反转录病毒,并最终筛选出分别携带上述基因的猪成纤维细胞克隆,为抗口蹄疫病毒转基因动物的研究奠定了基础。
- 孙丹丹李霄王婧尹熙俊康锦丹鲁月李太元金宁一
- 关键词：口蹄疫病毒反转录病毒单链抗体转基因
- 新型双表达盒真核载体的构建及功能验证
- 杜寿文金宁一李昌王宇航任大勇刘存霞孙丹丹朱娜李沂秦艳青
- 应用间接荧光抗体技术检测林蛙嗜水气单胞菌被引量：7
- 2010年
- 以感染嗜水气单胞菌的林蛙各组织脏器为抗原,以热灭活的嗜水气单胞菌为免疫原,免疫家兔制备兔抗嗜水气单胞菌血清为第一抗体,用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG作为二抗,建立了间接荧光抗体试验方法。分别采用2.5%戊二醛5 min、甲醇10 min、冷丙酮1 h 3种固定方法固定抗原,然后滴加不同稀释倍数的兔抗嗜水气单胞菌血清、羊抗兔IgG-FITC,于荧光显微镜下观察。结果表明,2.5%戊二醛固定腹水5 min,兔抗血清抗体效价为1∶80,荧光二抗的最佳稀释倍数为1∶4000。
- 白雪梅李太元杨兴李艳茹孙丹丹董丹
- 关键词：荧光抗体技术林蛙嗜水气单胞菌
- 新型鸡痘病毒穿梭载体的构建及其体外表达被引量：5
- 2012年
- 为构建用于筛选的新型鸡痘病毒载体,采用染色体步移技术对鸡痘病毒282E4株TK基因的下游序列进行测序,并结合扩增出的左右同源重组臂TKL、TKR片段、启动子、MCS及终止信号构建出三表达盒穿梭载体pTKE3。采用基因工程技术将绿色荧光蛋白EGFP基因克隆入3个启动子的下游,构建出pTKE3-A、pTKE3-B、pTKE3-C验证表达盒质粒。结果显示,构建的3个验证质粒分别与鸡痘病毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞,均可在转染12h后观察到绿色荧光。结果表明,构建的三表达盒载体均可成功表达外源基因,这为进一步构建多价重组鸡痘病毒活载体疫苗奠定了基础。
- 刘存霞李昌王茂鹏胡乐鹏靖杰杜寿文尹荣兰刘燕瑜任静强任大勇孙丹丹金宁一
- 关键词：鸡痘病毒穿梭载体
- IFITM3基因的克隆及其在真核细胞中的表达与定位研究被引量：1
- 2012年
- 目的:干扰素rhIFN-α2B体外诱导人胚胎肾细胞系293T细胞获得IFITM3基因,观察IFITM3基因在293T细胞中的表达与定位。方法:利用干扰素rhIFN-α2B体外诱导293T细胞获得IFITM3基因,采用RT-PCR技术扩增获得干扰素诱导的跨膜蛋白IFITM3全长cDNA,扩增产物连接至pMD18-T载体上,测序正确后,将IFITM3基因亚克隆至真核表达载体pVAX1中获得重组质粒pV-IFITM3,通过转染293T细胞进行表达与定位研究。结果:RT-PCR和Western blot结果表明,获得的目的基因IFITM3能够表达,且具有良好抗原活性;激光共聚焦显微镜观察显示,IFITM3基因表达后主要分布于细胞膜上。结论:成功获得IFITM3基因,并验证了其表达。该研究为基于IFITM3的抗病毒药物以及探讨其抗病毒机制研究奠定了坚实基础。
- 朱娜李昌郭焱李沂孙丹丹任静强杜寿文秦艳青王茂鹏田宇飞金宁一
- 关键词：克隆
- 新型三基因表达盒痘苗病毒转移载体的构建及评价
- 痘苗病毒广泛用于外源基因表达和基因工程重组病毒疫苗的研发，因此一种高重组率、高效表达、遗传稳定性优良的痘苗病毒转移载体非常重要。本研究为疫苗研制和基因治疗提供了有效的载体pSTKE，运用该载体制备的重组病毒可同时高效表达...
- 杜寿文金宁一李昌王宇航刘存霞任大勇孙丹丹朱娜李沂秦艳青
- 关键词：痘苗病毒穿梭载体基因转移
