翁少洁
- 作品数：10 被引量：35H指数：5
- 供职机构：军事医学科学院微生物流行病研究所更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 通过高表达Igf1/Bcl-2或Bcl-2/Cyclin E基因组合使CHO细胞适于在无蛋白培养基中抗凋亡培养被引量：5
- 2004年
- 哺乳动物细胞表达系统是生产重组蛋白药物最常用的表达系统。但在无蛋白培养基中 ,哺乳动物细胞生长活力差 ,且容易发生细胞凋亡 ,因而难以大规模培养。为解决此问题 ,应用双顺反子表达载体在CHO dhfr- 细胞中同时表达Igf 1 Bcl 2或Bcl 2 CyclinE基因组合 ,通过Bcl 2使细胞获得抗凋亡能力 ;通过Igf 1或CyclinE促进细胞生长分裂 ,使细胞获得在无蛋白培养基中生长的能力。以上述基因组合转染CHO dhfr- 细胞 ,应用Westernblot从G4 18抗性克隆中分别筛选到Bcl 2高表达克隆若干个 ,对其中表达Bcl 2最高的CHO IB3和CHO BC1做进一步Westernblot和流式细胞分析 ,确认此两个细胞株分别高表达Igf 1 Bcl 2和Bcl 2 CyclinE基因组合。分别通过撤去血清和加入放线菌素D诱导细胞凋亡 ,并以流式细胞术和DNALadder法检测细胞凋亡 ,证明CHO IB3和CHO BC1均具有较强的抗细胞凋亡能力。MTT法证明两个细胞株在不含血清的IMDM培养基中的增殖活力显著高于CHO dhfr- 对照细胞。在细胞培养瓶中的连续培养实验表明 ,CHO IB3和CHO BC1在本实验室设计的IMEM无蛋白培养基中的生长速度和活细胞数显著高于CHO dhfr- 对照细胞。提示此两个细胞系能够在无血清培养基中抗凋亡高活力生长 ,适于作为生物工程宿主细胞。
- 来大志翁少洁齐连权于长明付玲于婷陈薇
- 人IFN-β启动子基因报告质粒的构建及SARS-CoV3a和7a蛋白对IFN-β诱生作用的初步研究被引量：1
- 2006年
- 3a蛋白和7a蛋白是SARS-CoV的非结构蛋白,分别主要由SARS基因组中ORF3a和ORF7a所编码。在体内和体外感染病毒的细胞中均发现了有3a蛋白的表达。首先将pGL3-Control载体进行了改构,除去了SV40启动子基因,获得了pGL3-Enhancer载体,将获得的IFN-β启动子基因连入载体中,构建了带有人IFN-β启动子基因的荧光素酶报告质粒IP-21,并且通过实验证明所构建的质粒在干扰素的诱导剂NDV的作用下能够表达荧光素酶活性,照度计检测荧光素酶活性增强,从而验证了所构建的重组质粒的有效性。为了观察SARS-CoV非结构蛋白3a和7a对干扰素诱生途径的影响,将IP-21瞬转入稳定表达有3a和7a蛋白的CHO细胞,通过荧光素酶的信号强弱对3a和7a的作用进行分析,结果表明SARS-CoV的3a和7a蛋白能够刺激荧光素酶的表达,即在体外的细胞实验中,3a和7a能有效地激活IFN-β的启动子部分。此结果对进一步研究3a和7a的功能以及对SARS-CoV的致病机制的进一步研究有一定意义。
- 徐春娥付玲侯丽华翁少洁来大志李健民于婷于长明陈薇
- 关键词：SARS-COV
- SARS冠状病毒3a蛋白通过与CAML分子结合而抑制细胞凋亡
- 与其他冠状病毒相比,SARS冠状病毒/(SARS-CoV/)有很强的致病性。SARS病毒的这一特点必然与其独特的基因结构有关。生物信息学分析表明,SARS病毒含有与其它冠状病毒相似的S,N,E,M等结构基因以及编码复制酶...
- 翁少洁
- 关键词：SARS冠状病毒细胞凋亡
- 文献传递
- 人β干扰素基因的改构及其融合表达和纯化被引量：7
- 2002年
- 目的 :通过基因改构来提高人 β干扰素基因原核表达产物的稳定性和比活性。 方法 :用RT_PCR法从人外周血淋巴细胞中获得人 β干扰素基因。定点突变后 ,克隆至表达载体pGEX_2T。IPTG诱导该基因的表达 ,亲和层析和原位裂解法纯化表达产物。结果 :获得大量纯化产物 ,且稳定性和活性获得极大提高。结论 :基因改构可以提高人
- 来大志陈薇付玲齐连权于长明翁少洁王海涛
- 关键词：Β干扰素稳定性RT-PCRΒ干扰素纯化
- 两个新型多拷贝毕赤酵母表达载体的构建被引量：7
- 2002年
- 目的 :构建合适的载体用于外源基因在巴斯德毕赤酵母中的正确分泌表达。方法 :利用PCR技术 ,对已有载体pPIC9K进行改造 :在多克隆位点处增加一个NaeⅠ酶切位点 ;去除卡那霉素抗性基因中的一个XhoⅠ酶切位点。结果和结论 :成功地构建了pMEN9K ,pMEX9K两个载体 。
- 齐连权陈薇于长明来大志翁少洁王海涛
- 关键词：巴斯德毕赤酵母基因表达PCR
- 适于无血清贴壁培养的抗凋亡宿主细胞系CHO-IVB2的构建被引量：4
- 2004年
- 应用无血清培养基培养CHO细胞时 ,由于没有血清提供各种贴壁因子 ,细胞以悬浮的方式生长。在实际的大规模细胞培养中 ,CHO细胞往往以贴壁方式培养 ,要么贴壁于悬浮的微载体中 ,要么贴壁于固定的聚酯盘状介质或中空纤维中 ,而很少直接悬浮于培养基中。在无血清培养基中 ,Vitronectin单一组分可以促使CHO细胞的贴壁和扩增。通过双表达Igf_1和Bcl_2基因 ,已经构建了可以在无蛋白培养基IMEM中抗凋亡生长的细胞株CHO_IB3。在此基础上 ,构建了可以同时表达Igf_1、Vitronectin和Bcl_2三个蛋白的三顺反子表达载体pCI_NII_IVB。将该载体转染于CHO_dhfr- 细胞中 ,构建了一个细胞株CHO_IVB2。该细胞株可以在无蛋白培养基中抗凋亡生长 ,适于以贴壁的方式大规模培养 。
- 翁少洁来大志齐连权于长明付玲陈薇
- 关键词：CHO细胞细胞工程无血清培养基
- SARS-CoV3a和7a蛋白对IFN-β诱生的增强作用
- 本文对SARS-CoV3a和7a蛋白对IFN-β诱生的增强作用进行了研究。结果表明，SARS-CoV的3a和7a蛋白能够刺激荧光素酶的表达,即在体外的细胞实验中,3a和7a能有效地激活IFN-β的启动子部分。
- 徐春娥张晓鹏于长明陈薇付玲侯利华翁少洁来大志李健民易绍琼赵兴卉于婷
- 关键词：非结构蛋白基因编码病毒感染
- 文献传递
- 用于生产重组蛋白药物的抗凋亡CHO宿主细胞株的建立被引量：7
- 2003年
- 哺乳动物工程细胞在大规模培养生产重组蛋白时很容易发生细胞凋亡 ,从而导致生产过程提前终止 ,造成生产成本高昂。细胞代谢产物氨已被证明可以促进细胞凋亡 ,而线粒体膜整合蛋白Bcl 2可以通过促进线粒体膜完整性而抑制细胞凋亡。本实验应用谷氨酰胺合成酶加压系统在CHO工程细胞中高效表达中国仓鼠Bcl 2蛋白 ,使细胞具有抗凋亡能力的同时 ,利用谷氨酸和氨合成谷氨酰胺而有效降低培养基中氨的含量 。
- 来大志付玲于长明齐连权翁少洁于婷王海涛陈薇
- 关键词：CHO细胞谷氨酰胺合成酶哺乳动物细胞
- 应用人延伸因子1α亚基启动子和人工转录激活因子提高外源基因在CHO细胞中的表达被引量：5
- 2004年
- 表达载体的设计对于提高外源基因在哺乳动物细胞中的表达量十分重要 .而表达载体中最为重要的元件是启动子 .一些常用病毒来源的启动子 ,如巨细胞病毒即早期启动子 (PCMV IE)仅在S期激活 ,应用这类启动子表达外源蛋白需要宿主细胞不停增殖 ,这对于连续持久大规模培养的宿主细胞不现实 .而人延伸因子 1α亚基启动子 (PEF 1α)不受细胞周期限制 ,且启动子强度高于PCMV IE,对于大规模外源蛋白的生产较为理想 .首先构建了基于PEF 1α启动子的哺乳动物细胞表达载体pED5 ,在增殖缓慢的CHO细胞中 ,此载体表达外源蛋白的能力是应用PCMV IE启动子表达载体的 4 1倍 .由于启动子一般仅能决定基因转录的本底水平 ,而转录激活因子 (transcriptionactivators)对基因转录的影响更大 ,所以另把两个人工转录激活结构域AH和VP2接到λ噬菌体cⅠ蛋白的C端 ,它们通过cⅠ蛋白结合于已插入到PEF 1α启动子的TATA框上游约 2 0 0bp的λ噬菌体OR2 OR1序列上 ,而被“征募”到PEF 1α启动子TATA框附近 ,从而促进基因的转录 .把上述元件均整合进一个表达载体中 ,构建了两个新型表达载体pER AH和pER VP2 .pER AH表达外源蛋白的能力比不含转录激活因子的表达载体略高 ,而pER VP2表达外源蛋白的能力则比不含转录激活因子的表达载体高
- 来大志翁少洁于长明齐连权付玲于婷陈薇
- 关键词：基因表达CHO细胞
- 重组人组织型纤溶酶原激活剂衍生物在毕赤酵母中的表达
- 2007年
- 目的在毕赤酵母中表达重组人组织型纤溶酶原激活剂衍生物(rPAm),并检测rPAm的活性。方法用PCR从质粒pLFrGGI上扩增出目的蛋白(rPAm)基因,再亚克隆到酵母表达载体pMEX9K中,转化到宿主菌GS115,菌落PCR鉴定转化子,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定表达产物,再通过层析法纯化目的蛋白,用溶圈法测定目的蛋白的活性。结果表达的重组蛋白分子量约为50kD。纯化后的目的蛋白的纯度可达到95%。Western-blot显示能与抗tPA抗体特异性结合,纯化后rPAm比活性为5.02×105IU/mg,比活性与t-PA相当。结论成功构建了rPAm酵母表达工程菌,建立了对目的蛋白的纯化方法。
- 章晟陈薇于长明传玲杨秀旭徐俊杰刘树玲朱曼翁少洁于婷
- 关键词：毕赤酵母
