王瑞
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 供职机构：成都医学院检验医学院更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 重组肌氨酸氧化酶的制备和鉴定被引量：1
- 2014年
- 测定血清中肌酐的浓度是临床上诊断肾功能的一项重要指标。在利用偶联酶法测定的过程中,一种关键酶——肌氨酸氧化酶(SOX)(EC 1.5.3.1)的质量控制是我们首先要解决的一个重要问题。本文利用乳糖诱导重组肌氨酸氧化酶(r-SOX)基因在E.coli中高效表达,经300L发酵罐发酵培养,菌体终密度达到OD600值22,菌体湿重达30g/L,湿菌体含活性20U/g。重组肌氨酸氧化酶表达量占菌体可溶性蛋白的25%左右。菌体破碎液经55℃选择性热变性处理和Ni-Sepharose FF层析二步纯化,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析酶的纯度达97%以上,比活力达25U/mg,纯化倍数为14.4,活性收率为92.4%。纯化的酶经SDS-PAGE和分子筛层析法测定,其分子量分别为53kD和55kD,提示该酶结构为单一肽链。纯化的酶液和冻干粉均呈黄色,经三氯乙酸和热变性处理,发现其与核黄素以共价键的方式结合。此外,对该酶的稳定性和其中的干扰酶过氧化氢酶也做了进一步的考察。以上所取得的研究结果为此酶的开发和利用奠定了基础。
- 蒲静王瑞姚明东何中杰赵明孟尧
- 关键词：高密度发酵
- 重组尿酸酶发酵培养及制备的工艺条件被引量：2
- 2015年
- 利用含PET-Urate Oxidase表达质粒的重组E.coli JM109（DE3）菌株进行大规模发酵培养,拟建立一种高效、低成本的生产重组尿酸酶的技术工艺路线。取冻存的工程菌接种于含质量分数1%琼脂的种子培养基中进行培养,从划线平板上挑取单菌落接种于摇瓶中继续培养,最后以体积分数5%接种量接种于发酵培养基中,绘制生长曲线;以乳糖作为诱导剂与传统IPTG诱导方法进行发酵培养比较;菌体经高压均质机破碎、质量分数40%-60%硫酸铵分级沉淀,以及Q-Sepharose F.F.层析进行分离纯化。结果显示,乳糖作为诱导剂在300 L的发酵罐中进行培养可获得菌体湿质量2 700 g,目的蛋白质表达量占菌体可溶性蛋白质的30%左右,略高于IPTG诱导的效果;经分离纯化后该酶的纯化倍数可达原来的4.5倍,活性回收率为40%;纯化的重组尿酸酶经SDS-PAGE和HPLC分析,显示单一蛋白质色带和单一洗脱峰。成果为该酶的医学实际应用奠定了理论实验基础。
- 赵明何中杰王瑞姚明东师慧王振伟孟尧
- 关键词：乳糖发酵纯化
