俞辉
- 作品数：5 被引量：7H指数：1
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- TP17蛋白的重组表达及其在梅毒血清学诊断中的初步应用被引量：1
- 2013年
- 目的通过基因工程技术获得梅毒重组蛋白TP17,并探索其在梅毒血清学诊断中的初步应用。方法以PCR扩增获得TP17基因,构建pET28b-TP17原核表达载体,将其转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG诱导蛋白表达,重组蛋白经镍柱纯化后,以飞行时间质谱和免疫印迹法进行鉴定。建立基于TP17的ELISA间接法,通过检测临床患者的血清标本,评价其与化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)和梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)的检测符合率。结果成功构建了原核表达载体pET28b-TP17,重组蛋白TP17以包涵体形式存在,分子量约20kD。质谱和免疫印迹分析表明重组蛋白为梅毒蛋白TP17,并且能够与梅毒阳性血清发生特异性反应。基于TP17的ELISA法与CMIA法和TPPA法的符合率均为99.2%(125/126),3种方法检测梅毒特异性抗体的差异无统计学意义。结论基因工程技术获得的重组蛋白TP17能够与梅毒阳性血清发生特异性反应,有良好的临床应用前景。
- 俞辉林勇平张婷侯剑辉何丽斯刘忠民
- 关键词：梅毒基因工程酶联免疫吸附试验
- 梅毒螺旋体硫氧还原蛋白TP0100的原核表达和鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的构建梅毒硫氧还原蛋白TP0100基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达重组蛋白,并评价其在梅毒血清学诊断中的价值。方法构建pET-28b-TP0100重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)后诱导表达。经镍柱纯化,重组蛋白通过质谱和Western blot进行鉴定。以重组蛋白为抗原建立酶联免疫吸附试验(ELISA)间接法,并检测临床收集的梅毒血清。结果成功构建表达载体pET-28b-TP0100,测序结果表明质粒中的插入序列与GenBank中TP0100的基因序列相同。重组蛋白表达约占菌体总蛋白的40%,相对分子质量约为23×103。质谱和Western blot分别证实重组蛋白的酶解片段来自于TP0100蛋白,重组蛋白能与梅毒TPPA阳性血清发生特异性反应。ELISA检测20份梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)阳性血清和20份TPPA阴性血清,与TPPA方法的符合率分别为95%(19/20)和100%(20/20)。结论重组硫氧还原蛋白TP0100能够与梅毒患者阳性血清发生特异性反应,是一个潜在的梅毒血清学诊断抗原。
- 林勇平俞辉刘忠民
- 关键词：梅毒原核表达
- 梅毒血清学诊断用抗原Gpd蛋白的重组表达及鉴定
- 2012年
- 目的利用基因工程技术重组表达梅毒螺旋体Gpd蛋白,探讨其在梅毒血清学诊断中的应用。方法 PCR扩增Gpd基因序列,构建表达载体pET-28b-Gpd,将表达载体转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)并以IPTG诱导蛋白表达,经镍柱亲和层析纯化后,利用质谱和免疫印迹法鉴定重组蛋白。以重组蛋白建立间接ELISA法,并检测20份TPPA阳性和20份TPPA阴性血清去评价其在梅毒血清学诊断中的应用。结果 PCR扩增出约1.1kb的Gpd片段,成功构建重组质粒pET-28b-Gpd。表达的重组蛋白的相对分子质量约41×103,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的40%。质谱和免疫印迹分析证实重组蛋白为Gpd蛋白,并能够与梅毒患者血清发生免疫学反应。间接ELISA法测定TPPA阳性血清和TPPA阴性血清的符合率分别为95%(19/20)和100%(20/20)。结论重组Gpd蛋白能够与梅毒患者血清发生特异性的免疫学反应,是一种可潜在应用于梅毒血清学诊断的新抗原。
- 林勇平陆中奎俞辉刘忠民
- 关键词：梅毒基因工程血清学诊断
- TP47蛋白在梅毒血清学诊断中的应用被引量：4
- 2012年
- 目的采用原核基因工程技术重组表达梅毒螺旋体TP47蛋白,探讨其在梅毒血清学诊断中的应用。方法 PCR扩增获得TP47基因片段并构建pET28b-TP47原核表达重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG诱导蛋白质表达,经镍柱纯化后通过质谱技术进行鉴定。采用免疫印迹法测定其与梅毒患者血清的免疫反应性。建立基于重组TP47抗原的ELISA间接法并对30份TPPA阳性血清和75份TPPA阴性血清进行方法学验证。结果 PCR扩增获得约1.1kb的基因片段,成功构建原核表达载体pET28b-TP47。重组蛋白在细菌中以包涵体形式表达,约占菌体蛋白含量的70%,分子量约39000Mr,经纯化后其纯度约95%。经质谱分析表明重组蛋白为TP47蛋白。免疫印迹法证实TP47蛋白能够与梅毒患者血清发生特异性反应,ELISA测定TPPA阳性血清和阴性血清的符合率分别为97%(29/30)和97%(73/75)。结论通过DNA重组技术成功获得了梅毒螺旋体TP47蛋白,证实其与梅毒阳性血清具有良好的反应性,为研发新一代梅毒感染诊断试剂盒奠定了基础。
- 林勇平俞辉张婷林毅妍宋金龙刘忠民
- 关键词：梅毒基因工程血清学诊断
- 梅毒螺旋体TP0772蛋白的原核表达和免疫反应性鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的:利用原核基因工程技术克隆表达梅毒螺旋体TP0772基因,探讨其在梅毒血清学诊断中的应用。方法:PCR扩增获得TP0772基因,构建pET-28b-TP0772重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG诱导蛋白质表达,经镍柱纯化后通过质谱技术鉴定。采用免疫印迹法测定其与梅毒患者血清的免疫反应性。建立基于重组TP0772抗原的ELISA间接法并对30份TPPA阳性血清和25份TPP阴性血清进行方法学评价。结果:PCR扩增获得约850 bp的基因片段,成功构建原核表达载体pET-28b-TP0772。目的蛋白分子量约为32kDa,以包涵体的表达形式存在,约占菌体总蛋白的30%。经质谱技术和免疫印迹分析证实重组蛋白为TP0772蛋白,并能够与梅毒患者血清发生特异性结合反应。ELISA测定TPPA阳性血清和阴性血清的符合率分别为93%(28/30)和96%(24/25)。结论:通过DNA重组技术成功获得了重组TP0772蛋白,其与梅毒阳性血清具有良好的免疫反应性,为优化梅毒的血清学诊断方法奠定基础。
- 林勇平俞辉张婷刘忠民
- 关键词：梅毒原核表达免疫反应性
