- 重组表达人乙酰胆碱受体α1亚基胞外域蛋白被引量：2
- 2009年
- 目的获得大量正确折叠的重组人乙酰胆碱受体(AChR)α1亚基N末端胞外域(ECD)蛋白。方法用RT-PCR方法从TE671细胞中扩增出AChRα1亚基全序列,在此基础上再扩增出ECD基因序列并将其插入到原核表达载体pET16b。以构建的新载体转化E.coliBL21(DE3)pLysS,培养物以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并通过SDS-PAGE比较诱导前后蛋白表达情况。重组蛋白以Ni2+亲和层析纯化。蛋白透析复性后,以ELISA法检测活性。结果PCR产物大小为650 bp,与预计相符;所构建质粒经测序证实ECD核苷酸序列正确,并正确插入载体pET16b。诱导所产生的大量包涵体蛋白经复性后正确折叠且具活性。结论可通过原核表达获得大量正确折叠的可溶性重组人肌肉AChRα1亚基ECD蛋白。
- 孙辰婧徐江李柱一
- 关键词：重症肌无力乙酰胆碱受体
- 补体调节因子DAF治疗重症肌无力
- 目的本研究探讨补体调节因子-DAF对被动免疫的重症肌无力动物模型的治疗作用。方法通过克隆大鼠DAF的SCR1-4并插入到原核表达载体pET32a(+),根据表达结果选择纯化方式。pET32a表达载体的构建;DAFSCR1...
- 李柱一徐江宋琛陈辉
- 关键词：重症肌无力DAF
- 文献传递
- 中华眼镜蛇α-神经毒的纯化及其在烟碱型乙酰胆碱受体纯化上的应用被引量：1
- 2012年
- 目的从中华眼镜蛇粗毒中分离纯化其α-神经毒组分,并将此α-神经毒作为亲和层析的配基纯化烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)。方法采用凝胶过滤层析、阳离子交换层析逐步分离纯化中华眼镜蛇粗毒,通过125I-α-银环蛇毒素(αBtx)-nAChR结合抑制实验检测蛋白活性,SDS-PAGE检测蛋白的相对分子质量和纯度;亲和层析纯化nAChR,放射免疫沉淀法测nAChR活性。结果从5g中华眼镜蛇粗毒中共纯化得到约20mg眼镜蛇α-神经毒,该眼镜蛇α-神经毒有一定的125I-αBtx-nAChR结合抑制活性,其半数抑制浓度(IC50)约为αBtx的28倍。以纯化的α-神经毒制备的亲和介质,可吸附大鼠骨骼肌肌膜提取物中约84%的125I-αBtx结合活性,且此活性可以被0.2mol/L卡巴胆碱洗脱。结论用简单的液相色谱方法可从中华眼镜蛇毒中分离纯化α-神经毒,并且可以以其为配体从大鼠骨骼肌中纯化nAChR。
- 李佳徐江林烨沈佑晓刘毅张芳琳吴兴安徐志凯李柱一
- 关键词：受体
- 大鼠补体调节因子DAF功能区的表达纯化及功能鉴定
- 2006年
- 目的:重组表达促衰变因子(DAF)功能区的4个短的保守重复序列(SCR1-4)。方法:通过克隆大鼠DAF的SCR1-4并插入到原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导共表达,根据表达结果选择纯化方式。结果:诱导后表达产物为不溶蛋白,通过纯化包涵体并复性,得到了具有抑制致敏绵羊红细胞发生溶血的可溶性蛋白成分。结论:原核表达SCR1-4易于形成包涵体,稀释复性法适用于DAFSCR1-4包涵体的复性。
- 徐江张惠中林芳刘丽王燕任继鸿李柱一
- 关键词：DAF包涵体蛋白复性
- 抗乙酰胆碱受体单链抗体基因克隆与表达
- 2012年
- 目的重建含有抗乙酰胆碱受体(AChR)单链抗体1929#(single-chain Fv antibody 1929#,scFv1929#)基因的载体并在大肠杆菌(E.coli)进行表达,提高scFv1929#的可溶性表达量。方法用聚合酶链反应法(PCR)扩增载体pHEN1中的scFv1929#结构基因,将扩增产物定向克隆至载体pET32a(+)的多克隆位点中构建新的载体pET32a(+)-scFv1929#,经EcoR v和NotⅠ双酶切后进行鉴定,并将所构建载体转化入表达宿主E.coli BL21(DE3)plysS菌株内诱导表达后集菌并裂菌,将诱导前菌体、诱导后菌体,以及裂菌后所得诱导后上清、诱导后沉淀进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,并采用Western blot(WB)法进行鉴定。结果鉴定结果显示载体pET32a(+)-scFv1929#中所插入的scFv1929#基因片段大小为730bp,与预计相符,经测序确定该基因序列无误。SDS-PAGE电泳结果显示37℃下诱导前菌体、诱导后菌体、诱导后上清、诱导后沉淀中均可在相对分子质量(Mr)接近44 000处见到蛋白条带,其中诱导后菌体及诱导后沉淀中的条带较粗大。经WB法证实融合蛋白scFv1929#具有较高特异性。结论 scFv1929#表达载体pET32a(+)-scFv1929#被成功构建,并可在大肠杆菌中高效表达,其表达产物具有较好特异性。
- 陈辉李柱一徐江
- 关键词：单链抗体克隆
- 重组人乙酰胆碱受体α亚单位胞外域在CHO细胞中的表达被引量：1
- 2013年
- 目的获得具有生物学活性的重组人烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)α1亚基胞外域(ECD)蛋白。方法从TE761细胞中提取人nAChRα1亚单位全长基因,以PCR法扩增nAChRα1亚基ECD1-216,酶切后装入pcDNA3.1表达载体中,脂质体转染入CHO细胞,分别在转染后6～72 h的7个时间点进行荧光实时定量PCR鉴定ECD基因的表达水平,利用125I标记的银环蛇毒素测定细胞培养上清中ECD蛋白的表达。结果 Hα1-216 PCR后所得708 bp片段大小符合预计结果,测序所得核苷酸序列与GenBank中人AChRα1序列完全一致。所构建的新载体经酶切鉴定目的基因正确插入,载体构建成功。随着细胞培养时间的延长ECD基因mRNA表达水平逐渐增加,且ECD蛋白表达水平也不断提高。结论在CHO细胞成功表达了具有生物学活性的重组人nAChRα1胞外域蛋白。
- 林烨常婷徐江沈佑晓李佳吴兴安张芳琳徐志凯李柱一
- 关键词：重症肌无力乙酰胆碱受体CHO细胞
- 抗乙酰胆碱受体单链抗体原核表达载体及表达菌株的构建
- 2006年
- 目的将含有抗人乙酰胆碱受体(AChR)单链抗体基因的载体重新构建并建立表达菌株。方法采用聚合酶链反应(PCR)从质粒pHEN1中克隆单链抗体scFv1929#全长基因,将PCR产物再定向克隆至载体pET32a(+)的多克隆位点中,并转入大肠杆菌BL21(D E3)plysS以构建表达菌株。结果PCR产物约730bp,与预期一致,重组阳性克隆菌株JM109+pET32a(+)-scFv1929#经菌液PCR可见730 bp处有特异性条带,所提取质粒pET32a(+)-scFv1929#经PCR及酶切鉴定正确,经测序后证实scFv1929#的核苷酸序列正确并正确地插入载体pET32a(+)的读码框内。将新构建载体转化大肠杆菌BL21(D E3)plysS以获得表达菌株。结论已成功地重新构建含有抗AChR单链抗体基因的载体并建立大肠杆菌表达菌株BL21(D E3)plysS+pET32a(+)-scFv1929#,为今后表达抗AChR单链抗体scFv1929#融合蛋白打下基础。
- 陈辉李柱一徐江张惠中
- 关键词：单链抗体乙酰胆碱受体原核表达载体
- 抗人乙酰胆碱受体单链抗体1956#在大肠杆菌中的可溶性表达被引量：1
- 2008年
- 目的:重组表达抗人乙酰胆碱受体(AChR)单链抗体(scFv)1956#,提高scFv1956#的可溶性表达量。方法:用PCR扩增含抗人AChR scFv1956#的载体pHEN1中的scFv1956#结构基因,并将其插入到原核表达载体pET44a(+)。用重新构建的载体转化E.coli BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。用SDS-PAGE来比较更换载体及不同温度和时间对可溶性表达量的影响,并通过Western blot进行鉴定。结果:PCR产物大小为785bp,与预计相符;所构建质粒经测序证实scFv1956#核苷酸序列正确,并正确插入载体pET44a(+)。诱导后得到的可溶性表达量优于原载体pHEN1。结论:载体pET44a(+)表达的端融蛋白NusA可以帮助scFv1956#的正确折叠,从而获得大量可溶性表达。低温长时间诱导有助于提高可溶性表达的量。
- 宋琛徐江张芳琳白文涛李柱一
- 关键词：重症肌无力乙酰胆碱受体单链抗体NUSA
- PU-569 CD55原核表达及其在大鼠体内的代谢和生物学活性的测定
- 徐江李柱一
- 重组表达人乙酰胆碱受体α1亚基胞外域蛋白诱导大鼠重症肌无力方法
- 目的获得大量正确折叠的重组人乙酰胆碱受体(AChR)α1亚基N末端胞外域(ECD)蛋白诱导重症肌无力模型(EAMG)。方法用RT-PCR方法从TE671细胞中扩增出AChRα1亚基全序列,在此基础上再扩增出ECD基因序列...
- 孙辰婧张洪亮徐江高洁戚晓昆李柱一
- 文献传递
