- 微小RNA-21反义寡核苷酸对宫颈鳞癌SiHa细胞株细胞生物学特性影响的体内外实验研究被引量：7
- 2012年
- 目的探讨体内外微小RNA．21（miR-21）反义寡核苷酸对宫颈鳞癌SiHa细胞株细胞生物学特性的影响。方法miR-21反义寡核苷酸（miR-21-ASO）通过脂质体转染宫颈鳞癌SiHa细胞，即时定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测miR-21表达情况，采用四甲基偶氮唑盐（MTr）比色法、集落形成实验、流式细胞术等方法探讨抑制miR．21表达对SiHa细胞形态及生物学特性改变的影响。应用免疫组织化学MaxVision法、TUNEL（TdT—mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂盒检测移植瘤细胞增殖活性和凋亡情况。结果miR-21在SiHa细胞株中呈显著高表达，miR-21-ASO可使SiHa细胞中miR-21表达量显著降低（P〈0．05）。MTT法检测结果显示，转染miR-21-ASO后SiHa细胞的生长受到明显抑制（P〈0．05）。阴性对照组的细胞集落形成率为98．3％±2．0％，miR-21抑制组则为55．6％±1．4％，miR-21抑制组的细胞集落形成率受到明显抑制（P〈0．05）。流式细胞术检测显示，阴性对照组和miR-21抑制组的SiHa细胞凋亡率分别为6．7％±1．3％和29．4％±1．7％，miR-21抑制组的细胞凋亡率明显增加（P〈0．05）。裸鼠皮下移植瘤成瘤率，miR-21抑制组与阴性对照组的成瘤比例分别为3／8和6／8（P〈0．05）。裸鼠瘤体的Ki-67阳性指数，miR-21抑制组（42％）比阴性对照组（90％）显著下降。荧光TUNEL凋亡检测显示，miR．21抑制组裸鼠肿瘤细胞凋亡明显增多（P〈0．05）。结论miR-21-ASO可有效抑制宫颈鳞癌SiHa细胞中miR-21表达，影响癌细胞增殖活性，促进癌细胞凋亡，体内抑制SiHa细胞裸鼠移植瘤生长促进其凋亡。
- 王晓玫许静成志强彭全洲胡锦涛高利昆张石芬金红涛
- 关键词：微RNAS寡核苷酸类反义
- 人pEGFP-C2-PRDX3真核表达载体构建与在人髓母细胞瘤DAOY细胞中表达
- 2012年
- 目的构建人pEGFP-C2-PRDX3真核表达载体,并检测其在人髓母细胞瘤DAOY细胞中的表达。方法从人髓母细胞瘤DAOY细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法对编码PRDX3的基因片段进行扩增,应用基因重组技术,将目的片段亚克隆到pEGFP-C2真核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定后,用脂质体法将重组质粒转染入DAOY细胞,分别采用RT-PCR法、West-ern blot法检测PRDX3在DAOY细胞中的表达。结果双酶切及测序结果验证PRDX3片段正确插入pEGFP-C2质粒,转染后的PRDX3基因mRNA及蛋白质水平均明显上调。结论成功构建了具有报告基因-增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达载体pEGFP-C2-PRDX3,为进一步研究PRDX3基因在人髓母细胞瘤中的生物学功能奠定了基础。
- 王晓玫金红涛成志强彭全洲胡锦涛高利昆许静张石芬曾照成刘汉勇
- 关键词：真核表达载体
- Bcl-xl反义寡核苷酸转染对肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响
- 2016年
- 目的研究Bcl-xl反义寡核苷酸(ASODN)对肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响。方法将肺腺癌A549细胞分为细胞对照组(无脂质体及核酸)、脂质体(Lip)组(空脂质体,无核酸)、序列对照寡核苷酸(SCODN)组和ASODN组,设计合成特异性靶向Bcl-xl ASODN,用阳离子脂质体介导其转染肺腺癌A549细胞株。采用细胞计数试剂盒(CCK8)法检测A549细胞增殖抑制率;末端脱氧核苷酰基转移酶介导性d UTP切口末端标记(TUNEL)法检测A549细胞凋亡情况;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测A549细胞中Bcl-xlm RNA和蛋白表达水平。结果 ASODN和SCODN浓度为50 nmol·L^(-1)时,各组A549细胞增殖抑制率比较差异均无统计学意义(P>0.05);浓度为100、200、400 nmol·L^(-1)时,ASODN组A549细胞增殖抑制率均高于SCODN组和Lip组(P<0.05);ASODN对细胞增殖抑制作用随其浓度增加而增高,具有剂量依赖性(P<0.05)。细胞对照组、Lip组、SCODN组和ASODN组细胞凋亡率分别为(4.01±0.18)%、(5.23±0.22)%、(8.01±0.32)%和(41.50±1.91)%,ASODN组细胞凋亡率高于SCODN组、Lip组和细胞对照组(P<0.05)。ASODN和SCODN浓度为50 nmol·L^(-1)时,各组A549细胞中Bcl-xl mRNA表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05);浓度为100、200、400 nmol·L^(-1)时,ASODN组A549细胞中Bcl-xl mRNA表达量均低于SCODN组、Lip组和细胞对照组(P<0.05);ASODN组A549细胞中Bcl-xl mRNA表达量随浓度增加相应地下降(P<0.05);SCODN组和Lip组Bcl-xl mRNA表达量较细胞对照组下降,但差异均无统计学意义(P>0.05)。细胞对照组、Lip组、SCODN组和ASODN组A549细胞中Bcl-xl蛋白表达量分别为0.62±0.17、0.67±0.27、0.62±0.21和0.23±0.10,ASODN组A549细胞中Bcl-xl蛋白表达量低于细胞对照组、Lip组和SCODN组(P<0.05)。结论转染Bcl-xl ASODN可下调Bcl-xl基因表达,能有效抑制A549细胞增殖,并显著促进A549细胞凋亡;Bcl-xl基因有望成为肺腺癌基因治疗的新靶点。
- 郭晓静王晓玫刘汉勇金红涛张石芬许静
- 关键词：反义寡核苷酸BCL-XL基因治疗
- 反义miR-21抑制宫颈鳞状细胞癌CaSki细胞系生长体外研究被引量：1
- 2012年
- 目的探讨敲低miR-21表达对宫颈鳞状细胞癌细胞系CaSki增殖活性与凋亡的影响。方法实时荧光定量RT-PCR法检测正常宫颈组织、CaSki细胞转染前后miR-21的表达水平,采用MTT法、流式细胞术等技术检测转染后CaSki细胞增殖活性与凋亡的变化。结果 miR-21在CaSki细胞中表达水平为正常宫颈组织的3.25倍。CaSki细胞中转染反义miR-21(AS-miR-21)可显著抑制其表达。转染后24h、48h、72h、96h,MTT检测提示10nmol与20nmolAS-miR-21转染组中细胞增殖率较对照组明显降低(P<0.05),自48h抑制作用显现,且随着转染浓度增加,抑制作用增强,呈现剂量依赖性。细胞周期检测结果显示AS-miR-21转染组的G0/G1期细胞明显增多,S期细胞减少(P<0.05)。AnnexinⅤ联合PI技术检测细胞凋亡,结果显示AS-miR-21转染组早期凋亡细胞率[(23.40±2.16)%]明显高于空白对照组[(5.1±2.16)%]、阴性对照组[(6.87±0.55)%](P=0.000)。结论 AS-miR-21转染可敲低CaSki细胞中miR-21表达,并有效抑制细胞增殖活性,促进细胞凋亡。
- 王晓玫张石芬高利昆成志强彭全洲胡锦涛许静金洪涛
- 关键词：微RNASCASKI细胞
- 反义miR-21对荷人宫颈鳞癌裸鼠移植瘤生长和凋亡的影响被引量：1
- 2012年
- 目的构建荷人宫颈鳞癌裸鼠移植瘤模型,探讨干扰miR-21表达对移植瘤生长、凋亡的影响。方法将人工合成的反义寡核苷酸ASODN(AS-miR-21)转染SiHa细胞(抑制组),同时设阴性对照组和空白对照组,对数生长期的SiHa细胞分别接种于裸鼠皮下,绘制肿瘤生长曲线并计算肿瘤生长率。当肿瘤体积达0.2 cm3时采用AS-miR-21多点瘤周注射,观察其对移植瘤的影响。应用免疫组化技术、荧光TUNEL检测移植瘤细胞增殖活性和凋亡情况。结果 (1)成功构建人宫颈鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型,抑制组、阴性对照组及空白对照组成瘤率分别为37.5%、75.0%、100.0%,瘤体平均体积为(732.80±56.32)mm3、(1228.46±78.53)mm3、(1301.26±80.63)mm3,平均生长率为18.32%、30.71%和32.53%,瘤重为(0.73±0.05)g、(1.26±0.12)g和(1.35±0.25)g,抑制组与阴性、空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);(2)免疫组化显示抑制组裸鼠瘤体Ki67表达显著下降;荧光TUNEL凋亡检测显示抑制组裸鼠肿瘤细胞凋亡率明显增多;(3)注射治疗剂量AS-miR-21两周后观察肿瘤组织局部坏死严重,胞核裂解、消失,凋亡明显增加。结论 AS-miR-21可下调裸鼠人宫颈鳞癌移植瘤中miR-21的表达,抑制移植瘤生长和促进其凋亡。
- 王晓玫许静成志强彭全洲胡锦涛高利昆张石芬
- 关键词：微RNASSIHA细胞裸鼠
- 上调microRNA-383对人髓母细胞瘤D341细胞系中PRDX3表达的影响被引量：7
- 2012年
- 目的探讨microRNA-383(miR-383)对人髓母细胞瘤D341细胞系中PRDX3基因的表达及细胞增殖活性与凋亡等细胞功能学的影响。方法应用实时荧光定量PCR法检测人髓母细胞瘤D341细胞系、正常脑组织中miR-383及PRDX3 mRNA表达水平;采用Western blot法检测人髓母细胞瘤D341细胞系、正常脑组织中PRDX3基因、蛋白表达水平;人工合成miR-383模拟体(mimics)转染MBD341细胞系,采用cck-8法、流式细胞术等实验方法检测转染人髓母细胞瘤D341细胞系后各组D341细胞增殖与凋亡、细胞内活性氧水平、线粒体膜电位水平的变化。结果人髓母细胞瘤BD341细胞系中miR-383表达水平为正常脑组织的0.524倍,明显下调。而PRDX3基因mRNA表达水平为正常脑组织的5.214倍,蛋白表达水平较正常脑组织明显上调。miR-383 mimics转染D341细胞系24、48 h,实验组miR-383表达水平均明显高于空白对照组,且48 h作用更加明显;而PRDX3基因mRNA、蛋白表达水平48 h较空白对照组降低。cck-8法检测提示实验组中细胞增殖率降低(P<0.05)。An-nexinV-FITC法检测转染后24、48 h细胞凋亡结果显示miR-383 mimics实验组细胞早期凋亡率明显增高,且24 h作用较明显(P=0.000)。细胞内活性氧水平和线粒体膜电位水平检测结果分别显示,转染后24、48 h实验组较对照组细胞内活性氧水平明显升高,而线粒体膜电位水平较对照组明显降低。结论与正常脑组织相比,miR-383在人髓母细胞瘤D341细胞系中表达降低,PRDX3基因表达升高。上调miR-383可敲低D341细胞系中PRDX3基因表达,并可抑制D341细胞增殖活性,促进D341细胞凋亡,出现D341细胞内活性氧水平升高、线粒体膜电位水平降低的细胞功能学变化。
- 王晓玫张石芬成志强彭全洲胡锦涛高利昆许静金红涛
- 关键词：髓母细胞瘤细胞功能
