目的探讨重组转化生长因子-β3(TGF-β3)基因对大鼠肝星状细胞(HSC)内、外蛋白合成及分泌的影响。方法构建质粒pcDNA3.1(+)-TGF-β3和pcDNA3.1(+)-TGF-β1。稳定转染:通过脂质体介导的方法,将pcDNA3.1(+)-TGF-β1转染HSC-T6,经G418筛选建立稳定高表达pcDNA3.1(+)-TGF-β1的HSC-T6细胞阳性克隆。再将pcDNA3.1(+)-TGF-β3转染HSC-T6克隆细胞,用W estern b lot法和酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测细胞内外TGF-β1、Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9及金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1的蛋白表达量。结果pcDNA3.1(+)-TGF-β3转染HSC-T6阳性细胞克隆后,与单纯阳性克隆组相比,TGF-β1、Ⅰ型胶原、TIMP-1细胞内蛋白表达及培养上清中的分泌水平均明显降低(P<0.05),MMP-2的表达也降低,但两者间差异无统计学意义(P>0.05),而MMP-9的表达明显增高(P<0.05)。结论重组质粒pcDNA3.1(+)-TGF-β3能减少细胞内外Ⅰ型胶原的合成及分泌;通过调节MMP-9及TIMP-1的表达,可抑制细胞外基质的合成,促进其降解。
目的 观察重组转化生长因子β1(tgfβ1)和β3(tgfb3)基因对大鼠肝星状细胞株(hsc-t6)的基质金属蛋白酶-2(mmp-2)、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)及金属蛋白酶组织抑制剂-1(timp-1)表达的影响.方法 (1)构建质粒pcdna3.1(+)-tgfb,和pedna3.1(+)-tgfβ3;(2)瞬时转染:将pcdna3.1(+)-tgfβ1和pedna3.1(+)-tgfβ3分别及共同转染hsc-t6细胞,荧光定量pcr法和免疫印迹法检测转染后24、48和72 h时mmp-2、mmp-9、timp-1 mrna和蛋白的表达;(3)稳定转染:pcdna3.1(+)-tgfβ1转染hsc-t6细胞,经筛选建立高表达tgfβ1的hsc-t6细胞克隆,pcdna3.1(+)-tigfβ3转染细胞克隆,48 h后检测mmp-2、mmp-9和t1mp-1的表达.结果 (1)tgfβ1转染细胞后,mmp-2和timp-1明显增高(p＜0.05),mmp-9无变化;tgfβ3转染细胞后,mmp-2和mmp-9无变化,timp-1 mrna也无变化,但timp-1蛋白明显增高(p＜0.05);共转染组的mmp-2较空白组和对照组明显增加(p＜0.05),mmp-9无改变,timp-1较tgfβ1转染组明显下降(p＜0.05).(2)tgfβ3转染克隆细胞后,mmp-2无明显变化,mmp-9明显增加(p＜0.05),timp-1明显下降(p＜0.05).结论 重组tgfβ3基因可能通过促进mmp-2或mmp-9的活性和抑制timp-l的活性而发挥抗肝纤维化作用.
abstract：
objective to investigate the effects of transforming growth factorβ1(tgfβ1)and β3 (tgfβ3)gene transfer on mmp-2,mmp-9 and timp-1 expression in hepatic stellate cells(hsc-t6).methods tgfβ1 and tgfβ3 expression plagmids were constructed.the recombinant expression plasmid pcdna3.1(+)-=tgfβ1 and pcdna3.1(+).tgfβ3 were transfected or cotransfected into hsc-t6.at 24,48 and 72 h after transfection,the expression of mmp-2,mmp-9 and timp-1 mrna were detected by real-time quantitative pcr,and the expression of mmp-2,mmp-9 and timp-1 protein were detected by western blot.the recombinant expression plasmid pcdna3.1(+).tgfβ1 was transfected into hsc-t6,and positive clones were selected by g418.the positive clones were transfected by the recombinant expression plasmid pcdna3.1(+).tgfβ1,and the e
目的 观察重组转化生长因子艮（TGF-β3）基因对大鼠肝纤维化细胞模型胶原合成及沉积的影响。方法 （1）构建质粒pcDNA3．1（＋）-TGF-B]和pcDNA3．1（＋）·TGF-β1。（2）将pcDNA3．1（＋）-TGF-β1，转染大鼠肝星状细胞（HSC）-T6，经G418筛选建立稳定高表达TGF-β1的HSC-T6细胞阳性克隆。（3）pcDNA3．1（＋）-TGF-β3转染HSC-T6阳性细胞克隆，荧光实时定量PCR法检测TGF-β3 mRNA的表达；荧光实时定量PCR法及Western印迹法分别检测TGF-β1、I型胶原、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9及TIMP-1的mRNA和蛋白表达情况。结果 （1）pcDNA3．1（＋）-TGF-β3和pcDNA3．1（＋）-TGF-β1质粒均可转染HSC-T6细胞，以转染48h时转染效率最高，达28．2％。（2）pcDNA3．1（＋）-TGF-β3转染HSC-T6细胞阳性克隆后，与单纯阳性克隆组相比，TGF-β1，mRNA表达无明显改变，而蛋白表达明显低（0．48±0．07 vs 0．66±0．14，P=0．023）；I型胶原mRNA及蛋白的表达明显低（mRNA：7．2±1．0 vs 13．7±0．4，P=0．010，蛋白：0．45±0．21 vs 0．82±0．13，P=0．041），MMP-2 mRNA及蛋白较低，但差异无统计学意义（均P〉0．05），MMP-9mRNA及蛋白表达明显多（均P〈0．05），TIMP-1mRNA及蛋白表达明显低（均P〈0．05）。结论 （1）重组TGF-β3真核表达载体构建正确，在转染阳性克隆细胞48h后获得高效表达；（2）稳定高表达TGF-β1，的HSC-T6细胞阳性克隆可作为肝纤维化细胞模型；（3）pcDNA3．1（＋）-TGF-β3转染阳性克隆能减少胶原合成，并通过调节基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达对胶原沉积起抑制作用。
