国家自然科学基金(30400125)
- 作品数：11 被引量：19H指数：4
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- LMO3过表达对胶质细胞增殖的作用
- 2010年
- 构建重组质粒pcDNA4/HisA-LMO3,转染C8-D1A胶质细胞,对照组为pcDNA4/HisA空载体质粒转染组和未转染组,MTT观察各组细胞的体外生长情况,流式细胞术(FCM)测定各组细胞的细胞周期和凋亡细胞百分比,Western-blot检测LMO3转染后凋亡相关蛋白的表达变化,从而观察LMO3基因对C8-D1A胶质细胞体外生长的影响.RT-PCR、Western印迹显示pcDNA4/HisA-LMO3转染组LMO3mRNA及LMO3蛋白表达水平明显高于对照组;与对照组细胞相比,转染组细胞的增殖能力明显高于空载体对照组及C8细胞(P<0.01),S期细胞增加,G0/G1期细胞减少,C8细胞转染LMO3后可以促进C8细胞从G0/G1期进入S期,从而促进细胞的增殖.
- 惠玲吕同德王建峰王晓辉哈小琴张军莉杨桂兰鞠英
- 关键词：基因转染胶质细胞增殖
- LMO3 mRNA在小鼠脑发育过程中的表达被引量：4
- 2006年
- 目的：研究不同发育时期小鼠脑内LMO3的表达．方法：采用以SYBR Green Ⅰ为荧光染料的定量RT-PCR及以地高辛标记的cRNA为探针的原位杂交组织化学法检测LMO3基因在小鼠脑发育过程中的表达．结果：FQRT-PCR结果表明，LMO3在出生前高表达，P7d后表达水平急剧下降，至成年都维持在一个较低的水平．LMO3 mRNA在小鼠胚胎期E10．5d即有表达，但仅限于整个脑泡组织内，胚体其他区域均为阴性；E11．5d脑区信号逐渐加强，无核团及脑区的特异性，胚体其他部分仍为阴性；E15．5～P0d期LMO3阳性信号在几乎所有观察的脑区均有广泛而较强的着色；P7d LMO3阳性信号较出生前变弱，分布逐渐集中；P14～P60d LMO3mRNA表达范围较P7d逐渐缩小，但仍有广泛表达，阳性信号主要集中于不同核团，表达有强弱之分．结论：LMO3基因可能与小鼠出生前脑的发育以及出生后特定脑区神经元的特化及特性维持有关．
- 惠玲蔡文琴纪华吕同德杨金升赵治华
- 关键词：原位杂交组织化学小鼠
- 钙整合素结合蛋白CIB的原核表达及多克隆抗体的制备与亚细胞定位被引量：5
- 2009年
- 目的:构建钙整合素结合蛋白(calcium-and inte-grin-binding protein,CIB)的原核表达载体,制备小鼠抗人CIB的多克隆抗体并探讨其亚细胞定位。方法:采用RT-PCR方法从人脑组织扩增CIB的cDNA片段,利用DNA重组技术构建原核表达载体pET32a-CIB,转入BL21(DE3)中,以IPTG诱导BL21(DE3)表达CIB融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白CIB的表达。用含CIB融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒为抗原免疫小鼠制备抗血清,抗血清分别经Protein G、抗原亲和层析后用Western blot及免疫组化方法进行鉴定。结果:通过重组表达获得CIB抗原蛋白,免疫小鼠并纯化抗血清得到特异性的抗CIB抗体,该抗体能检测细胞内源性CIB蛋白的表达;同时免疫组化结果显示:CIB在SHG44、Hhu7细胞株中主要定位于细胞质。结论:成功克隆CIB基因并制备了特异性的小鼠抗人的CIB多克隆抗体,对进一步研究CIB的功能奠定了基础。
- 石洁惠玲张煦王晓辉杨金升吕同德赵治华哈小琴
- 关键词：CIB基因重组多克隆抗体亚细胞定位
- 钙整合素结合蛋白CIB真核表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达被引量：2
- 2007年
- 目的构建钙整合素结合蛋白(calcium-andintegrin-bindingprotein,CIB)的真核表达载体,了解它在真核细胞中的表达及定位。方法从人脑组织分离总RNA,采用RT-PCR获得CIB开放读框序列,克隆至真核表达载体pCMV-myc,构建表达带myc表达标签的真核表达载体pCMV-myc-CIB,将其转染至NIH3T3细胞中,免疫组化鉴定其在细胞中的表达及定位。结果序列分析表明克隆的CIB序列与GeneBank报道的序列一致,脂质体转染入NIH3T3细胞中,用myc抗体检测到目的蛋白myc-CIB的表达。结论pCMV-myc-CIB表达载体构建成功,并在真核细胞中得到了正确表达,CIB蛋白主要定位于细胞质中。
- 惠玲王晓辉袁碧波杨金开吕同德惠斌蔡文琴
- 关键词：CIB基因克隆真核表达
- LMO3 mRNA在小鼠中枢神经系统的表达定位被引量：5
- 2006年
- 目的 观察神经特异性转录因子LMO3mRNA在小鼠中枢神经系统中的定位。方法 原位杂交组织化学染色。结果LMO3mRNA阳性神经元可见于大脑、小脑、丘脑、脑干、脊髓，在小鼠中枢神经系统中，LMO3mRNA阳性反应产物主要位于细胞质和突起内。强阳性信号主要出现于大脑皮质的Ⅱ一Ⅵ层、梨状皮质、内嗅皮质、海马的CA1区、齿状回、中脑的黑质致密部、红核、室旁核、巨细胞网状核、外侧网状核、三叉神经脑桥核、面神经核、三叉神经运动核、舌下神经核等部位；中等强度着色主要分布于扣带前皮质、嗅球、海马的CA2区、梨状内核、杏仁核等部位；海马的CA3区、尾壳核、苍白球、杏仁复合体、丘脑、三叉神经脊束核、疑核、中缝核团、小脑间置核及外侧核、浦肯野细胞可见弱的阳性细胞。结论LMO3基因在CNS的广泛分布提示它除了在多巴胺神经递质的活动中起作用外，还参与了机体的学习记忆、嗅觉的调节。
- 惠玲蔡文琴吕同德
- 关键词：中枢神经系统原位杂交组织化学小鼠
- 神经特异性转录因子DAT1酵母双杂交诱饵载体的构建被引量：1
- 2005年
- 目的:用神经特异性转录因子DAT1构建酵母双杂交系统中的诱饵载体。方法:根据GenBank中提供的DAT1序列设计引物,以小鼠脑组织cDNA文库为模板,PCR扩增DAT1,并与pLexA载体连接,测序鉴定。用醋酸锂法转化酵母菌EGY48,在选择性培养基上观察pLexA-DAT1在EGY48中的表达。结果:PCR扩增出的DNA片段约490bp,大小正确,构建的融合表达载体pLexA-DAT1,测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确。转化了pLexA-DAT1的酵母菌EGY48在加有X-Gal的SD/Gal/Raf/-His/-Ura营养缺陷型诱导平板上菌落不变蓝,证明LexA-DAT1融合蛋白本身不具有激活p8op-LacZ报告基因的能力,可以用作进一步的实验。结论:获得了在酵母细胞中正确表达且未自主激活报告基因的融合表达载体pLexA-DAT1,可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”。
- 惠玲蔡文琴王小平
- 关键词：酵母双杂交
- 神经特异性转录因子DAT1基因的表达被引量：4
- 2005年
- 采用生物信息学分析、细胞培养和RT-PCR等方法,以初步解DAT1基因在小鼠主要组织及神经系统相关肿瘤细胞中的表达.生物信息学的基因表达谱分析发现与DAT1同源的EST有100多条,大多数EST分布于胎脑、成年脑、脑肿瘤、肺及肺部的良性肿瘤等组织.SAGE分析发现DAT1在脑及神经系统肿瘤组织中表达非常广泛;RT-PCR方法检测发现DAT1只在脑组织中特异表达,而其它组织如心脏、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、睾丸、卵巢等未见表达;DAT1在培养的正常星形胶质细胞C8中不表达,在胶质瘤、神经母细胞瘤等细胞株中有不同水平的表达.由于DAT1是一种LIM蛋白,而LIM蛋白在细胞的分化、发育调控和肿瘤形成中有重要作用,DAT1在脑及神经系统相关肿瘤中的较高表达提示,DAT1在神经系统中有重要功能,并可能与神经系统肿瘤的发生相关.
- 惠玲蔡文琴吕同德王玲
- 关键词：肿瘤
- DAT1基因在大鼠神经干细胞分化中作用的初步研究被引量：3
- 2005年
- 目的 研究DAT1转染后不同诱导条件下DAT1在神经干细胞的表达以及DAT1过表达对神经干细胞分化的影响。方法 构建真核表达载体pEGFP C1 DAT1、pcDNA4/hisA DAT1,采用lipofectamine2 0 0 0脂质体介导法转染培养的胚胎大鼠皮层神经干细胞(neuralstemcells ,NSCs) ,免疫组化染色,荧光显微镜观察。结果 DAT1瞬时转染神经干细胞后的诱导分化实验表明,DAT1转染可使NSCs分化为Mash 1阳性的细胞增加,DAT1的高表达有促进NSCs向神经元方向分化的作用;血清诱导分化及自然分化后DAT1在分化细胞中的表达定位发生了变化,同时这种变化也反映在NSCs分化的不同阶段。结论 不同的外界诱导因素或在NSCs分化的不同时期,DAT1可能通过与不同的转录因子的结合,从而在不同的信号通路中影响NSCs的分化。
- 惠玲刘建军姚忠祥蔡文琴
- 关键词：神经干细胞分化
- 神经特异性转录因子DAT1绿荧光蛋白表达载体的构建及其在C8细胞中的表达定位
- 2005年
- 目的:构建神经特异性转录因子DAT1与绿荧光蛋白融合表达的表达载体,并检测其在C8星形胶质细胞中的表达。方法:采用基因重组技术将DAT1基因和绿色荧光蛋白基因融合,构建绿荧光蛋白表达载体pEGFP-C1-DAT1,测序验证序列无误后,用脂质体法将重组质粒转入C8细胞,荧光显微镜观察DAT1的表达及定位。结果:测序验证结果表明,重组质粒含有DAT1全长编码序列,转染实验表明EGFP-DAT1能在C8细胞中正确表达,且DAT1蛋白主要定位于细胞核中。结论:DAT1全长cDNA基因绿色荧光蛋白表达载体构建成功,在C8细胞中可以正确表达,为进一步研究DAT1的功能奠定了基础。
- 惠玲蔡文琴吕同德
- 关键词：基因克隆真核表达
- 携带钙整合素结合蛋白基因逆转录病毒表达载体的构建及包装细胞系的建立被引量：1
- 2011年
- 目的:构建钙整合素结合蛋白(CIB)的逆转录病毒表达载体,并建立包装细胞系。方法:质粒pet32-CIB经EcoRI和XhoI双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒表达载体pLXSN-CIB,PCR及双酶切鉴定后,通过脂质体转染导入包装细胞pA317,G418稳定筛选后获得抗性克隆,NIH3T3细胞进行逆转录病毒颗粒滴度测定。结果:重组逆转录病毒表达载体pLXSN-CIB质粒测序结果与GenBank中序列一致,经PCR及酶切鉴定证实,获得了大约574bp的基因片段,且正确插入pLXSN-CIB载体中;建立了pA317-CIB包装细胞系,采用NIH3T3细胞测定病毒滴度为6.81×105CFU/mL。结论:pLXSN-CIB结构正确,成功构建了CIB基因的逆转录病毒表达载体并建立了pLXSN-CIB包装细胞系。
- 王晓辉惠玲吕同德哈小琴王剑峰张军莉杨霄鹏
- 关键词：CIB逆转录病毒载体PLXSN
