中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(QN2009064)
- 作品数：7 被引量：21H指数：3
- 相关作者：陈鹏李学俊张海纳邓丹丹杨龙雨更多>>
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- 发文基金：国家自然科学基金中央级公益性科研院所基本科研业务费专项更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 灵杆菌非特异性核酸酶的原核表达、纯化及活性分析被引量：7
- 2011年
- 以灵杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增非特异性核酸酶(Non-specific nuclease,NU)基因,并克隆到pMAL-c4X载体上构建重组表达载体pMAL-c4X-NU。经测序及BLASTN发现其与灵杆菌Serratia marcescens核酸酶基因的同源性为97%。将构建的表达载体pMAL-c4X-NU转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导实现了胞内表达78 kDa的麦芽糖结合蛋白-NU融合蛋白(Maltose-binding protein-NU,MBP-NU),其最佳诱导表达条件为37℃,0.75 mmol/L IPTG诱导1.5 h。用Amylose resin纯化得到了目的蛋白。活性检测表明MBP-NU具有同时降解DNA和RNA的活性,在37℃、pH 8.0时活性最高,比活力为1.11×106 U/mg,目标蛋白的纯化效率可达10.875 mg/L。纯化的目标蛋白中无蛋白酶活性存在。0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、1 mmol/L苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)以及150 mmol/L KCl对MBP-NU的活性几乎无影响,因此MBP-NU可作为蛋白质纯化过程中核酸的高效降解酶。
- 陈鹏杨海艳李慧婧杨龙雨李学俊
- 关键词：融合蛋白
- 抗自溶烟草蚀纹病毒蛋白酶的原核表达和纯化及活性分析
- 2011年
- 利用QuikChangeSite-Directed Mutagenesis Kit将自溶性烟草蚀纹病毒蛋白酶(tobacco etch virus Protease,TEVP)219位的Ser(S)突变为Val(V),经测序验证的S219V突变质粒pMAL-TEVPS219V电转化大肠杆菌BL21Star(DE3),并优化异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度、温度、时间对TEVP表达的影响。结果表明,突变的TEVP表达最适条件为24℃,0.75mmol/L IPTG诱导11h。经金属离子螯合层析纯化得到高纯度,高活性的突变TEVP蛋白酶,比活力为1 048U/mg。每升菌液可纯化17.2mg目标蛋白。
- 陈鹏石小青
- 关键词：原核表达定点突变
- 苦荞类过敏原的原核表达及多克隆抗体制备被引量：5
- 2011年
- 以苦荞种子发育期全长cDNA文库中获得的与甜荞16 kD过敏原同源的基因BALP(Buckwheat Allergen-like protein,BALP;GenBank登录号GO496294)为基础,构建了原核表达载体pET47b-BALP,实现了在大肠杆菌Rosetta gami2(DE3)中的高效表达,并对诱导表达的时间和IPTG的浓度进行了优化。利用钴离子螯合层析纯化了重组蛋白并制备了高效价的抗BALP多克隆抗体。结果表明,克隆的该苦荞类过敏原与已报道的甜荞16 kD过敏原在氨基酸序列上具有83%的相似性,该苦荞类过敏原以包涵体的形式表达,最佳诱导时间为6 h,IPTG浓度为0.4 mmol/L。Western blotting显示天然的BALP仅存在于苦荞种子的清蛋白中。原核表达体系的建立和多克隆抗体的制备为进一步探讨BALP在苦荞麦中的功能以及研究BALP结构与功能的关系奠定了基础。
- 李学俊郭彦飞闫倩陈鹏
- 关键词：苦荞原核表达多克隆抗体
- 苦荞10kD过敏原的重组表达及部分性质分析被引量：2
- 2014年
- 以苦荞种子灌浆期cDNA文库中获得的苦荞10 kD过敏原基因序列TBAP10(tartary buckwheat 10 kD allergen protein,TBAP10;GenBank登录号JK729379.1)为基础,构建重组表达载体pET47b-TBAP10,重组蛋白在大肠杆菌BL21 Star(DE3)中以包涵体形式表达。经包涵体复性和钴离子螯合层析纯化目的蛋白,并对其过敏活性、热稳定性及在模拟胃肠环境中的稳定性进行了分析。Western blotting显示该蛋白与苦荞16 kD过敏蛋白Fag t2存在免疫交叉反应。竞争性ELISA证明重组蛋白TBAP10具有与荞麦过敏患者血清IgE特异的结合活性;TBAP10具有强的热稳定性,能耐受15 min的沸水浴;模拟胃肠环境的消化结果显示TBAP10对胃蛋白酶具有强的耐受性,但对胰蛋白酶无耐受性。
- 陈鹏封雪王磊邓丹丹李学俊
- 关键词：原核表达
- 苦荞黄酮-3-羟化酶截短体的原核表达与多克隆抗体制备被引量：5
- 2013年
- 为了制备苦荞黄酮-3-羟化酶的多克隆抗体,该研究以苦荞种子灌浆期cDNA文库中获得的苦荞黄酮-3-羟化酶基因截短体(truncated Flavanone-3-hydroxylase,TrF3 H)序列为基础,采用PCR扩增F3 H的截短序列编码区(TrF3 H),构建了原核表达载体pET47b-TrF3 H,并转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行诱导表达,将经钴离子螯合层析柱纯化后的目的蛋白切胶回收后制备了高效价的多克隆抗体。结果表明:pET47b-TrF3 H在大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中以包涵体的形式高效表达。蛋白质印迹显示,制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原,天然的黄酮-3-羟化酶蛋白在苦荞的未成熟种子中大量表达。原核表达体系的建立和多克隆抗体的制备为进一步探讨F3H在苦荞中功能奠定了基础。
- 李玉萍邓丹丹张海纳李学俊陈鹏
- 关键词：苦荞原核表达多克隆抗体
- 大麦纤维素合成酶截短体的重组表达及多克隆抗体制备被引量：1
- 2011年
- 对大麦纤维素合成酶(Hordeum vulgare CesA,Hv-CesA)的蛋白质序列进行疏水性分析和跨膜区预测,获得截短的亲水性非跨膜区特征序列,采用PCR扩增截短序列编码区,定向克隆入N端带有His标签的pET-28a(+)表达载体中,并转化大肠杆菌进行诱导表达,利用钴离子螯合层析纯化重组表达蛋白,并制备高效价的多克隆抗体。结果表明,截短的Hv-CesA基因在大肠杆菌Rosetta gami2以包涵体的形式高效表达,western blotting显示制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原。
- 李学俊李新宇李迟园陈鹏
- 关键词：大麦纤维素合成酶原核表达多克隆抗体
