海外青年学者合作研究基金(30128023)
- 作品数：9 被引量：23H指数：3
- 相关作者：马春红孙汶生刘素侠高立芬张利宁更多>>
- 相关机构：山东大学宾夕法尼亚州立大学解放军第八十八医院更多>>
- 发文基金：海外青年学者合作研究基金国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- IFN-γ对TRAIL诱导HBV相关性肝癌细胞凋亡的调节作用被引量：6
- 2003年
- 目的 以转染了HBV全基因组、并稳定表达HBV病毒颗粒的HepG2 .2 .15细胞为细胞模型 ,探讨IFN γ对新型凋亡分子TRAIL(TNF相关的诱导凋亡配体 )诱导凋亡的影响 ,并初步探索其发生机制。方法 以流式细胞仪检测IFN γ和TRAIL作用前后 ,HepG2 .2 .15细胞的凋亡率。分别用流式细胞术和半定量RT PCR的方法检测IFN γ作用 0、6、12和 2 4h后 ,细胞表面膜结合型TRAIL和TRAIL受体mRNA的表达。用HBsAg和HBeAgELISA检测试剂盒测定IFN γ作用 0、6、12和 2 4h后 ,HBV病毒颗粒的分泌表达状况。结果 TRAIL单独作用、IFN γ单独作用、TRAIL和IFN γ联合作用后 ,HepG2 .2 .15细胞的凋亡率分别为 9.12 %、5 .84%和 46 .6 8% ,表明IFN γ可以显著上调TRAIL诱导的细胞凋亡。IFN γ作用后 ,细胞表面膜型TRAIL的表达有显著上调 ,而部分与TRAIL诱导凋亡相关的TRAIL受体的表达也有不同程度的上调 ,并且IFN γ可以抑制HepG2 .2 .15细胞HBV病毒颗粒的分泌。结论 转染HBV全基因组的HepG2 .2 .15细胞对TRAIL诱导的凋亡相对耐受 ,而IFN γ却可以逆转这种耐受 ,使其变得对TRAIL诱导的凋亡敏感。其发生机制可能是通过IFN γ上调细胞表面TRAIL及其受体的表达 ,以及抑制HBV病毒颗粒的分泌实现的。
- 韩丽辉孙汶生马春红刘素侠王晓燕于建国张利宁陈有海
- 关键词：IFN-ΓTRAILHBV肝癌细胞凋亡
- 重组人可溶性DR5蛋白的表达、制备及其生物活性检测被引量：1
- 2004年
- 目的:纯化毕赤酵母GS115菌株表达的重组人可溶性死亡受体5(DR5)蛋白,并研究其对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)所诱导细胞凋亡的阻断效应?方法:大量扩增可溶性DR5酵母表达载体转化阳性的毕赤酵母GS115菌株,收集上清,利用ProBondTM亲和层析柱纯化获得重组可溶性DR5蛋白,用SDS-PAGE?Western Blot检验纯化产物的特异性和纯度?用MTT法检测纯化的可溶性DR5蛋白对TRAIL诱导人宫颈癌细胞系Hela细胞凋亡作用的阻断效应?结果:转化阳性的毕赤酵母GS115菌株可成功表达分子量为26 kD的可溶性DR5蛋白,经ProBondTM亲和层析柱纯化,SDS-PAGE?Western Blot鉴定,结果显示获得了高纯度的重组人可溶性DR5蛋白,蛋白产量达20 μg/ml;体外活性检测结果显示,纯化的可溶性DR5蛋白可部分阻断TRAIL诱导的Hela细胞的凋亡,阻断率最高达53.6%?结论:经纯化后的重组人可溶性DR5蛋白可有效阻断TRAIL诱导的细胞凋亡反应?
- 梁晓红孙汶生高立芬马春红韩丽辉王晓燕张宁郭春
- 关键词：HELA细胞受体DR5细胞凋亡
- TWEAK及IFN-γ在诱导表达乙肝病毒的HepG2.2.15细胞凋亡中的协同作用被引量：1
- 2003年
- 以转染了HBV全基因组、并稳定表达HBV病毒颗粒的HepG2 2 15细胞为细胞模型 ,研究新型凋亡分子TWEAK对HBV感染细胞的作用机制。MTT法检测TWEAK和IFN γ对HepG2 2 15细胞的杀伤效应。流式细胞术(FCM)分析TWEAK和IFN γ作用后 ,HepG2 2 15细胞的凋亡率及细胞周期变化。HBsAg和HBeAgELISA检测试剂盒测定TWEAK与IFN γ作用 2 4小时后 ,HBV病毒颗粒的分泌表达状况。TWEAK对于HepG2 2 15细胞有较弱的杀伤效应和诱导凋亡效应 ,但是与IFN γ联合作用后 ,HepG2 2 15细胞的凋亡率显著上调 ,细胞周期阻滞在G0 G1期 ,并且TWEAK与IFN γ能够协同抑制HepG2 2 15细胞病毒颗粒的分泌。TWEAK在IFN γ的参与下 ,可以诱导HBV相关的HepG2 2 15细胞发生较强烈的凋亡反应 ,这提示 ,在HBV感染者体内的炎症反应环境中 ,TWEAK极有可能通过与炎性因子的协同效应参与对病毒感染细胞的杀伤效应。
- 孙汶生韩丽辉马春红张秋刘素侠张利宁曹英林陈有海
- 关键词：TWEAKIFN-ΓHEPG2.2.15细胞凋亡干扰素-Γ
- TRAIL诱导HBV转染肝癌细胞BEL-7402凋亡的作用及机制研究被引量：4
- 2005年
- 目的 研究肝癌细胞BEL- 74 0 2感染HBV前后,TRAIL诱导其凋亡的敏感度变化及作用机制。方法 构建含1.1倍HBV全基因组的真核表达载体pcDNA3 1.1HBV ,转染人肝癌细胞BEL -74 0 2 ,G4 18稳定筛选,建立HBVadr亚型体外转染的细胞模型。原位末端标记(TUNEL)检测TRAIL诱导的凋亡反应,并通过设立TRAIL联合其可溶性受体sDR5 (sDR5与TRAIL结合后,可特异性阻断TRAIL诱导凋亡) ,以证实该凋亡是由TRAIL特异性诱导的。琼脂糖凝胶电泳(DNAladder)检测染色体DNA的断裂情况。流式细胞术、半定量逆转录聚合酶链反应检测HBV感染前后细胞表面TRAIL各受体的表达。双荧光素酶报告基因系统检测抑制凋亡的核转录因子NF κB的活性。结果 成功构建了包含HBV全基因组的真核表达载体pcDNA3 1.1HBV ,转染BEL 74 0 2、经G4 18稳定筛选后得到HBVadr亚型转染的细胞模型BEL 74 0 2 1.1HBV。TRAIL诱导BEL 74 0 2、BEL 74 0 2 pcDNA3及BEL 74 0 2 1.1HBV的凋亡率分别为30 .5 %、2 9.8%和76 % (P <0 .0 1) ;经sDR5特异性阻断后,凋亡率分别为0 .9%、0 .8%和0 .9% ,证明凋亡是由TRAIL特异性诱导的。TRAIL作用2 4h后,琼脂糖凝胶电泳可见BEL- 74 0 2 1.1H-BV较BEL- 74 0 2、BEL 74 0 2 pcDNA3染色体DNA断裂的现象更为明显。无论RNA水平还?
- 张秋孙汶生马春红高立芬刘素侠王晓燕张利宁陈有海
- 关键词：乙型肝炎病毒肝癌肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体凋亡
- HBV全基因真核表达载体的构建及表达被引量：2
- 2003年
- 目的:为诱导HBV特异性CTL,构建HBV全基因真核表达载体,并对其在细胞中的表达进行了初步研究。方法:以EcoRⅠ酶切pBR322-2HBV和pcDNA3,回收完整的HBV基因片段及线性化的载体pcDNA3,T4DNA连接酶连接HBV和pcDNA3,转化、筛选,酶切鉴定HBV的插入方向。以脂质体将构建的pcDNA3-HBV转染HepG2肝癌细胞,经G418筛选,ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达,RT-PCR检测转染细胞中PreS1mRNA的表达。结果:经酶切鉴定获得正向插入的pcDNA3-HBV,转染HepG2后,建立了新的肝癌细胞系HepG2.02G,细胞培养上清中可检测到高水平的HBsAg,PreS1mRNA在转染细胞中表达。结论:经体外重组,获得携带全长HBV基因片段的pcDNA3-HBV表达载体,并可在肝癌细胞中稳定表达。
- 高立芬孙汶生马春红刘素侠梁晓红陈有海
- 关键词：肝炎病毒乙型真核细胞
- 四元复合体介导C-MYC反义RNA抑制肝癌细胞生长增殖被引量：1
- 2005年
- 目的探讨四元复合体介导的C-MYC反义RNA转移系统对肝癌细胞系HepG2.2.15致瘤性的体内外抑制作用。方法C-MYC反义RNA四元复合体体外瞬时转染HepG2.2.15细胞,流式细胞术检测C-MYC蛋白的表达水平、细胞凋亡率及细胞周期的变化,MTT法测定细胞增殖代谢活性。以HepG2.2.15细胞制备荷瘤裸鼠模型,局部瘤内注射C-MYC反义RNA四元复合体或联合注射IFN-α,称量瘤重,免疫组化方法检测肿瘤组织C-MYC蛋白的表达。结果C-MYC反义RNA可显著降低细胞C-MYC蛋白的表达水平,使细胞生长停滞于G0/G1期。体内抑瘤实验显示,反义治疗组瘤体C-MYC蛋白表达降低,瘤重(1.72±0.16)g,显著低于生理盐水对照组(P<0.05)。联合IFN-α注射组抑瘤效果更佳。结论肿瘤组织靶向性C-MYC反义RNA转移系统在体内外均可有效降低C-MYC蛋白的表达,抑制细胞的生长增殖。体内联合IFN-α可取得更佳的抑瘤效果。
- 梁晓红孙汶生曲守方马春红刘素侠高立芬王晓燕
- 关键词：生长增殖HEPG2.2.15细胞介导荷瘤裸鼠模型抑瘤效果
- AFP增强型四元复合体介导N-ras反义RNA抑制HepG2.2.15细胞成瘤性的研究被引量：1
- 2004年
- 目的 观察AFP增强型四元复合体介导的N ras反义RNA转移系统对HBV转基因肝癌细胞系HepG2 .2 .15致瘤性的体内外抑制作用。方法 构建含有N ras反义RNA的AFP增强型四元复合体 ,体外瞬时转染HBV转基因HepG2 .2 .15细胞 ,流式细胞术检测转染前后N ras蛋白表达水平、细胞凋亡率及细胞周期的变化 ,同时建立稳定表达N ras反义RNA的肝癌细胞系HepG2 .2 .15 /as ras,绘制转染前后生长曲线。体内抑瘤试验分别以HepG2 .2 .15或HepG2 .2 .15 /as ras细胞制备荷瘤裸鼠模型 ,比较二者成瘤率。HepG2 .2 .15成瘤组局部瘤内注射N ras反义RNA四元复合体 ,研究其对肿瘤的抑制作用。结果 AFP增强型四元复合体介导N ras反义RNA体外瞬时转染HepG2 .2 .15细胞可显著降低胞内N ras蛋白的表达水平 (P <0 .0 5 ) ,使细胞生长停滞于G0 /G1期 ,且可诱导细胞凋亡。体内抑瘤实验显示 ,HepG2 .2 .15 /as ras细胞注射组成瘤率 ( 4 0 % )显著低于HepG2 .2 .15细胞注射组( 10 0 % )。瘤内注射N ras反义RNA四元复合体可使肿瘤体积明显缩小。结论 AFP增强型四元复合体介导的N ras反义RNA转移系统可降低HBV转基因肝癌细胞HepG2 .2 .15N ras蛋白的表达水平 ,逆转其恶性行为 。
- 梁晓红孙汶生马春红孔建平马亚斌曹英林刘素侠高立芬王晓燕郭春
- 关键词：N-RAS基因反义RNA肿瘤抑制
- pcDNA3-HBV瞬时转染对巨噬细胞活性的影响被引量：1
- 2005年
- 目的利用HBV全基因真核细胞表达载体pcDNA3-HBV研究HBV感染后对巨噬细胞活性的影响,探讨慢性乙型肝炎患者免疫耐受发生的机制。方法常规制备小鼠腹腔巨噬细胞,分别将pcDNA3-HBV、pcDNA3质粒DNA与绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNApEGFPN1以9∶1混合,利用脂质体转染试剂盒,共转染小鼠腹腔巨噬细胞。转染后72h,半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测HBV前S1、TNFα、白介素(IL)-1βmRNA的表达,流式细胞术测GFP的表达强度、检测核因子κB(NF-κB)蛋白的表达,利用Griess反应检测转染前后培养上清液中NO的水平。结果流式细胞术结果表明,pcDNA3-HBV与pcDNA3转染的巨噬细胞中GFP的表达率无明显差异,pcDNA3-HBV转染的巨噬细胞中检测到前S1mRNA的表达。通过与βactin相比,pcDNA3-HBV转染的巨噬细胞中TNF-α、IL-1βmRNA的表达量显著低于空载体对照组(P<0.01);pcDNA3HBV转染的巨噬细胞表达NFκ-BRelA蛋白的百分数与空载体对照组相当,但平均荧光强度显著低于空载体对照组(pcDNA3HBV转染组为125.05;pcDNA3转染组为203.88);pcDNA3-HBV转染组巨噬细胞产生NO的水平显著低于pcDNA3转染组(分别为15.0±0.6,45.0±1.3,P<0.01)。结论pcDNA3HBV转染后使巨噬细胞NFκB活性显著降低,TNF-α、IL-1βmRNA的表达及NO的产生水平明显下降。
- 高立芬孙汶生马春红张利宁曹英林刘素侠梁晓红刘华
- 关键词：巨噬细胞活性瞬时转染半定量逆转录聚合酶链反应PCDNA3HBV转染真核细胞表达载体
- 乙型肝炎病毒对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体诱导凋亡的影响及其机制被引量：7
- 2002年
- 目的 研究乙型肝炎病毒 (HBV)转染后 ,细胞对肿瘤坏死因子 (TNF)相关的凋亡诱导配体 (TRAIL)诱导的凋亡的敏感度变化及作用机制。通过人肝癌细胞HepG2及转染了HBV全基因组的HepG2 2 15细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感度研究 ,探讨HBV感染对细胞凋亡的影响及其机制。方法 流式细胞仪检测TRAIL诱导的凋亡反应和细胞表面TRAIL蛋白的表达 ,酶联免疫吸附试验检测细胞培养上清中分泌型TRAIL蛋白质的表达 ,半定量逆转录聚合酶链反应检测TRAIL受体和其转导通路中凋亡拮抗分子FLIP的表达。结果 HepG2和HepG2 2 15对TRAIL诱导的凋亡率分别为5 1 6 0 %和 9 12 %。与HepG2相比 ,HepG2 2 15细胞表面TRAIL蛋白质及其受体的表达都有不同程度的下调 ,而抵抗细胞凋亡的分子—FLIP的表达却显著上调 (P <0 0 1) ,两细胞系上清中分泌型TRAIL的表达量差异无显著意义 (P >0 0 5 )。结论 HBV转染可以抵抗TRAIL诱导的细胞凋亡 ,可以下调细胞表面TRAIL蛋白质及其受体的表达 ,但使FLIP的表达显著上调。这能从一定程度上解释HBV感染逃逸机体免疫监视 ,持续存活 。
- 韩丽辉孙汶生马春红张利宁曹英林宋静陈有海
- 关键词：乙型肝炎病毒肿瘤坏死因子凋亡诱导配体脱噬作用
