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牛病毒性腹泻病毒陕西株的分离与NS_(5b)基因序列测定被引量：5: 2008年; 【目的】分离并鉴定陕西省牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)。【方法】采集腹泻犊牛的肠系膜淋巴结,处理后接种于MDBK细胞,盲传,逐日观察是否有细胞病变产生。采用病毒蚀斑技术对病毒克隆纯化后,提取其RNA,进行RT-PCR鉴定。将扩增的NS5b基因克隆入pMD18-T载体中,采用碱裂解法小量提取质粒,并对质粒进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切、SalⅠ单酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行核苷酸序列测定及分析。采用病毒蚀斑试验测定分离毒株的半数组织培养感染量(TCID50)。【结果】盲传4代后细胞出现典型、规律的细胞病变。RT-PCR扩增出预期长度(360 bp)的基因片段,核苷酸序列分析结果表明,所扩增的基因为牛病毒性腹泻黏膜病病毒NS5b基因,其与BVDV VEDEVAC株NS5b基因核苷酸序列有99%同源性。BVDV陕西株的半数组织培养感染量(TCID50)为3.6。【结论】成功分离了牛病毒性腹泻病毒陕西株,为陕西省BVDV的防治提供了理论依据。; 马秋明王学艳王晶钰何维明; 关键词：牛病毒性腹泻病毒 RT-PCR 细胞病变

基于B/S的奶牛主要疫病诊断专家系统的建立被引量：2: 2010年; 为了提高基层兽医和养殖管理人员对奶牛主要疫病的诊断水平,辅助兽医进行奶牛主要疫病诊断,使专家的知识和经验得到最大程度的利用,解决基层兽医从业人员短缺和疾病诊断准确率低的问题,同时,为奶牛疫病预警系统提供高质量的基础数据,并增进广大养殖企业和兽医人员与专家之间的交流,我们设计了奶牛主要疫病诊断专家系统。该系统基于B/S(Browser/Server)模式,结合奶牛疫病和专家系统的研究成果,应用JSP+Tomcat+MySQL等软件进行设计。系统可实现奶牛主要疫病的在线诊断和查询,同时用户可就生产中遇到的问题与专家进行在线实时交流。; 王晶钰雷萌桐景旭王芳刘红彦薛媛媛昝林森; 关键词：专家系统奶牛疫病 B/S

流产型布鲁菌Omp10、Omp25蛋白的表达纯化与鉴定被引量：2: 2012年; 获得高纯度具有生物学活性的重组布鲁菌Omp10、Omp25融合蛋白,并进行抗原性的分析。将用PCR扩增出的布鲁菌Omp10、Omp25基因片段分别克隆到原核表达载体pET-32α中,构建pET-32α-Omp10/Omp25原核表达质粒。将其转入大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中,用IPTG诱导表达,经HisTrap HP亲和层析柱分离纯化,分别用Western-blot和间接ELISA检测产物的抗原性。基因测序及酶切鉴定证明pET-32α-Omp10/Omp25原核表达载体构建成功。SDS-PAGE表明,Omp10、Omp25融合蛋白均以包涵体的形式在大肠杆菌中高效表达。经过包涵体的变性、复性及亲和层析纯化,成功获得了大小分别为34 000和44 000的融合蛋白,与预测的相对蛋白分子质量一致。Western和间接ELISA试验证明纯化的Omp10、Omp25融合蛋白能被免疫的牛布鲁菌阳性血清所识别。结果表明,成功获得了布鲁菌Omp10、Omp25融合蛋白,且均具有一定的免疫原性,通过血清学反应证实,Omp10、Omp25蛋白为布鲁菌病临床诊断试剂盒的研制奠定了基础。; 张三东王晶钰王利勤杨幼聪马超陈婷董睿李成山任娟娟刘万华; 关键词：布鲁菌纯化抗原性

布鲁菌病多重PCR快速检测方法的建立及应用被引量：11: 2010年; 根据GenBank中登录的布鲁菌(Brucella)omp31、bp26、omp10外膜蛋白基因序列,针对同一种病原,各设计合成了一对特异性引物,通过优化引物浓度组合,建立了检测布鲁菌472 bp、290 bp、162 bp片段的多重PCR快速检测方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法从布鲁菌标准菌株中扩增出了特异性的目的片段,而对大肠埃希菌等细菌的扩增结果均为阴性。经过对10倍倍比稀释的模板进行检测,多重PCR的敏感度为最低可检出1.1×10-3ng的DNA,在感染布鲁菌病奶牛乳汁模拟标本中最低可检出细菌数为80 cfu/mL。不同人员用该方法重复检测,结果均一致,表明重复性好。应用该方法对88份临床疑似布鲁菌感染的奶牛乳样进行了检测,结果检出17份阳性,阳性检出率约为19.3%。检测结果表明,该方法具有特异、敏感、重复性好等优点,可用于奶牛布鲁菌病的临床检测及流行病学监测等。; 王晶钰张三东刘红彦李河林程媛媛李宇立战美娜; 关键词：布鲁菌外膜蛋白基因多重PCR

布鲁菌病多重PCR快速检测方法的建立及应用: 根据GenBank中登录的布鲁菌(Brucella)omp31、bp26、omp10外膜蛋白基因序列,针对同一种病原,各设计合成了一对特异性引物,通过优化引物浓度组合,建立了检测布鲁菌472 bp、290 bp、162 ...; 王晶钰张三东刘红彦李河林程媛媛李宇立战美娜; 关键词：布鲁菌外膜蛋白基因多重PCR; 文献传递

牛传染性鼻气管炎病毒的增殖培养及纯化: 【目的】制备出可用于IBRV检测及单克隆抗体制备所需的抗原。【方法】本试验通过将IBRV-oxford标准毒株接种于牛肾细胞(MDBK),30～48h细胞病变达80%时收毒的方法来培养增殖病毒。病毒细胞培养物经反复冻融3...; 王晶钰陈婷李河林王利勤; 关键词：牛传染性鼻气管炎病毒增殖纯化; 文献传递

牛乳中产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A的双重PCR检测法被引量：3: 2010年; 建立牛奶乳样中产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A的双重PCR检测方法。根据产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A基因序列分别设计了2对特异性引物,分别从产气荚膜梭菌和金黄色葡萄球菌参考菌株的肉汤培养物中提取DNA,进行PCR扩增,并进行特异性、敏感性试验和临床样品检测。经过PCR反应条件的优化,建立了产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A的双重PCR检测方法,均扩出了相应的目的条带。该方法将参考菌株的肉汤培养物稀释1 000倍后仍可扩出目的条带,且对大肠埃希菌等的PCR检测为阴性。对临床采集的50份乳品样本分别用细菌分离培养法和PCR方法进行检测,两种方法的符合率达90%以上,但双重PCR检测方法具有特异性强和敏感性高的特点。; 张曼王晶钰; 关键词：产气荚膜梭菌 Α毒素金黄色葡萄球菌肠毒素A PCR检测

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国家科技支撑计划(2006BAD4A11)