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pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体的构建与鉴定被引量：4: 2014年; 目的构建pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因重组表达载体,并对其进行初步鉴定。方法根据重组体pcDNA3-p30-ROP2酶切位点和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因序列等因素设计合成引物,扩增HBsAg目的基因片段,再应用酶切、连接等分子生物学技术将HBsAg目的基因克隆至pcDNA3-p30-ROP2表达载体中。应用聚合酶链反应(PCR)初筛,再采用酶切、测序等技术对构建的重组表达载体pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2进行鉴定。结果 PCR扩增出HBsAg基因片段,构建了pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2多基因真核表达载体。PCR与酶切结果显示,该基因片段大小均与理论值相符;测序结果显示该重组表达载体包含了p30-ROP2和HBsAg目的基因的完整序列。结论成功构建了多基因重组表达载体pcDNA3-HBsAg-p30-ROP2,为进一步研究多基因核酸疫苗奠定了基础。; 魏庆宽王英婷闫运琴肖婷李瑾徐超刘功振刘娟美仲维霞尹昆付斌闫歌黄炳成; 关键词：乙肝表面抗原

pEGFP-N1-HBsAg-ROP2多基因重组表达质粒的构建及表达鉴定: 2018年; 目的构建p EGFP-N1-HBs Ag-ROP2重组质粒,并转染HEK293T细胞进行表达鉴定,为弓形虫病核酸疫苗的研制奠定基础。方法根据HBs Ag基因序列和pc DNA3-p30-ROP2重组质粒酶切位点设计引物,PCR扩增HBs Ag基因,经酶切、连接、转化,利用HBs Ag基因替换p30基因,构建pc DNA3-HBs Ag-ROP2重组质粒;经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,将HBs Ag-ROP2片段与p EGFP-N1真核表达载体相连,构建p EGFP-N1-HBs Ag-ROP2重组表达质粒,转染HEK293T细胞,观察其蛋白表达水平。结果 HBs Ag片段PCR产物约700 bp,与理论值相符;构建pc DNA3-HBs Ag-ROP2重组质粒,双酶切电泳后得到约5.4 kb和1.9 kb的两条带,与预期结果相符。p EGFP-N1-HBs Ag-ROP2双酶切后产生约4.7 kb和1.9 kb的条带,经测序鉴定,与Gen Bank发表的序列同源性为99.84%。目的基因已成功转染入HEK293T细胞中,且正确表达,蛋白浓度为3.08 mg/ml。结论成功构建p EGFP-N1-HBs Ag-ROP2重组表达质粒,转染HEK293T细胞能正确表达。; 马荣肖婷李瑾孙慧徐超徐超尹昆尹昆赵桂华崔勇朱嵩刘功振魏庆宽; 关键词：乙型肝炎 PEGFP-N1 质粒构建

弓形虫表面抗原SAG2基因的克隆表达纯化及鉴定被引量：1: 2015年; 目的构建弓形虫表面抗原2(SAG2)基因重组质粒并在大肠埃希菌中表达。方法根据SAG2基因序列设计并合成引物,用PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因片段,再克隆到p GEX-4T载体中,构建重组质粒。重组质粒经酶切鉴定并测序后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blotting分析其反应原性。结果 SAG2基因PCR产物大小约为561 bp,与预期相符。重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的SAG2融合蛋白分子量约为47 ku,该蛋白可被GST标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫SAG2基因,表达蛋白具有反应原性。; 王卫艳李瑾魏庆宽贾凤菊肖婷徐超尹昆黄炳成; 关键词：刚地弓形虫基因克隆融合蛋白蛋白纯化

弓形虫多基因核酸疫苗构建及其免疫保护性研究被引量：7: 2012年; 目的构建弓形虫多基因核酸疫苗,评价其免疫保护性。方法 PCR扩增热休克蛋白(HSP70)基因片段,克隆到pcDNA3 ROP2 p30重组质粒中,构建pcDNA3 ROP2 p30 HSP70多基因核酸疫苗。采用该疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠脾淋巴细胞及全血CD4+、CD8+,血清、脾淋巴细胞培养液中IgG、IgM、IgA和IFNγ、TNF、IL 2、IL 4、IL 12等,并进行弓形虫攻击感染实验。结果应用PCR扩增出916 bp HSP70基因片段,成功构建pcDNA3 ROP2 p30 HSP70重组体,其中包含HSP70蛋白基因读码框内的完整序列。该弓形虫多基因核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫,实验组小鼠血清抗体滴度高,CD4+和CD8+均增殖明显,组间差异有统计学意义(FCD4+=45.00,FCD8+=15.01,P均<0.01);其血清及脾细胞培养液中IFNγ、IL 2和IL 12含量均明显升高,尤以血清中升高显著。攻击实验结果显示,实验组小鼠存活时间明显延长。结论 pcDNA3 ROP2 p30 HSP70多基因核酸疫苗具有较强的免疫原性,能产生较好的免疫保护作用。; 魏庆宽; 关键词：刚地弓形虫表面抗原P30 热休克蛋白70 核酸疫苗

乙肝表面抗原载体多价重组核酸疫苗研究进展被引量：1: 2012年; 研究表明,乙肝病毒的包膜蛋白HBsAg不仅可以作为疫苗的理想候选分子,还可作为基因工程疫苗的理想载体,用来成功构建多种重组核酸疫苗。本文概述了以乙肝表面抗原为载体,重组或联合其他病毒、寄生虫、细胞因子等其他基因制作多价核酸疫苗的研究进展。; 肖婷郭根灵辛宪云魏庆宽; 关键词：乙肝表面抗原

弓形虫pcDNA3-p30-ROP2-HSP70复合核酸疫苗免疫保护性的研究被引量：10: 2012年; 目的研究pcDNA3-p30-ROP2-HSP70复合核酸疫苗的免疫保护作用。方法 150只BALB/c小鼠随机分为5组,其中3实验组,每鼠分别肌肉注射pcDNA3-p30-ROP2-HSP70、pcDNA3-p30-ROP2、pcDNA3-ROP2各50μg;2对照组每鼠分别注射pcDNA3空质粒50μg、PBS 50μL。共免疫3次,每次间隔2w,末次量加倍。末次免疫后2w,各组分别取6只小鼠的血清和脾组织,检测CD4+、CD8+及各细胞因子。各组其余小鼠腹腔注射RH株弓形虫速殖子500个/每鼠,观察其存活时间等。结果 pcDNA3-p30-ROP2-HSP70复合核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应。小鼠血清抗体滴度高并能识别重组ROP2蛋白抗原;免疫接种后CD4+和CD8+均增殖明显,组间有显著性差异(F=45.00,P<0.01;F=15.01,P<0.01),实验组CD4+/CD8+比值增加明显,各组间有显著性差异(F=9.17,P<0.01);其脾、淋巴结细胞培养液及血清中白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-12、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)均有不同程度的升高,尤其是血清中升高最为显著。弓形虫攻击感染后,实验组与对照组比较,实验组小鼠存活时间明显延长。结论该复合核酸疫苗具有较强的免疫原性,能产生良好的免疫保护作用。; 李瑾肖婷黄炳成仲维霞修海迪王英婷韩广东魏庆宽; 关键词：刚地弓形虫核酸疫苗免疫保护

乙肝表面抗原和弓形虫棒状体分泌抗原多功能真核表达载体的构建与鉴定被引量：1: 2013年; 目的探讨通过体外扩增乙肝表面抗原(HBsAg)基因,构建真核表达载体pcDNA3-HBsAg-ROP2的可行性。方法根据乙肝S基因序列及pcDNA3-p30-ROP2酶切位点等情况设计、合成引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术,扩增HBsAg基因片段;应用回收、纯化、酶切、连接等技术,将HBsAg基因替换pcD-NA3-p30-ROP2中的p30基因,并进行酶切、PCR扩增及测序鉴定。结果 PCR扩增出约0.7 kb的目的基因HBsAg,成功构建pcDNA3-HBsAg-ROP2重组载体。PCR、酶切结果与理论相符,重组体包含了HBsAg和ROP2基因的完整序列。结论利用体外扩增乙肝表面抗原,可成功构建乙肝和弓形虫多功能重组载体pcDNA3-HBsAg-ROP2。; 魏庆宽肖婷李瑾马丽萍王林王英婷闫运琴高建丽朱嵩仲维霞尹昆付斌张佃波闫歌黄炳成; 关键词：弓形虫基因重组

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山东省自然科学基金(2009ZRC03083)