黑龙江省自然科学基金(ZD200812)
- 作品数：10 被引量：40H指数：5
- 相关作者：相文华郭巍赵立平李红梅姬媛媛更多>>
- 相关机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所东北农业大学沈阳农业大学更多>>
- 发文基金：黑龙江省自然科学基金中央级公益性科研院所基本科研业务费专项江苏省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 马流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立被引量：5
- 2011年
- 为建立一种快速、有效的检测马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的方法,以EIV中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)制备的多克隆抗体为捕获抗体,原核表达的核蛋白(NP)制备的单克隆抗体为检测抗体,在国内首次建立了检测EIV的双抗体夹心ELISA方法。用该检测方法分别检测EIV、马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型和马乙型脑炎病毒阳性样品。结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性;与常规检测EIV的血凝试验相比,其敏感性是后者的2.5～10倍;同时与H7N7亚型EIV有交叉反应。攻毒试验结果表明该方法可有效检测鼻腔分泌物中的EIV。该方法的建立为EIV的检测及早期防控提供了有效工具。
- 姬媛媛郭巍王晓钧王征卢刚赵立平李红梅相文华
- 关键词：马流感病毒多克隆抗体单克隆抗体双抗体夹心ELISA
- 湖北株H3N8亚型马流感病毒HA基因的序列测定及其HA蛋白遗传特性分析被引量：3
- 2010年
- 2008年从湖北省分离到1株H3N8亚型马流感病毒A/equine/Hubei/6/08。以2002年美国KENTUKY株为模板设计HA基因测序引物,进行RT-PCR,然后测定该分离株的HA基因核苷酸序列。经NCBI上Blast同源性比较发现,与A/equine/Newmarket/5/2003(H3N8)同源性较高为98.7%。HA蛋白遗传进化分析表明该毒株隶属于H3N8亚型马流感病毒中的美洲系福罗里达亚系。该株与OIE现在推荐的疫苗候选株A/equine/Kentuck-y/5/2002(H3N8)HA1蛋白氨基酸序列比对发现有3处氨基酸替换位点;与OIE以往推荐的疫苗候选株A/e-quine/Kentucky/1/1994(H3N8)比对发现有11处氨基酸替换位点。研究结果表明该分离株可作为中国研制马流感疫苗的候选株。
- 黄文强郭巍赵立平盛名巍王宇李红梅相文华
- 关键词：H3N8亚型马流感病毒HA基因
- 马疱疹病毒糖蛋白G基因C-末端的原核表达被引量：3
- 2012年
- 为获得马疱疹病毒1型(EHV1)和4型(EHV4)糖蛋白G(gG),对克隆载体pMD-1gG和pMD-4gG分别进行BamHⅠ+SalⅠ和EcoRⅠ+HindⅢ双酶切,将所得片段分别插入表达载体pGEX-6P-1和pET28a(+)中,构建了重组质粒pGEX-1gG和pET-4gG。经双酶切和序列鉴定为阳性后,将重组质粒pGEX-1gG转化入大肠杆菌BL21(DE3)、重组质粒pET-4gG转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达后对表达产物进行SDS-PAGE分析。结果显示,分别在35和17ku处出现与预期大小相符的目的条带。Western-blot结果证实,目的蛋白均具有良好的反应原性。表明,成功实现了EHV1gG和EHV4gG蛋白的正确表达,初步鉴定其具有良好的反应原性。
- 田志革郭巍相文华曲娟娟
- 关键词：原核表达
- 中国华南、华中、东北和西北地区马动脉炎病毒(EAV)感染马血清流行病学调查被引量：6
- 2012年
- 马病毒性动脉炎(EVA)是一种由马动脉炎病毒(EAV)引起马属动物主要通过呼吸系统和生殖系统传播的传染病,是危害养马业及赛马业的重要疾病之一。本试验应用纯化EAV全病毒为抗原建立EAV-IgG间接ELISA方法与西班牙INGEZIM-ARTERITIS试剂盒分别检测华南、华中、东北和西北地区共计383份马血清样品。其结果为:华南地区赛马动脉炎阳性率为26%,华中地区赛马动脉炎阳性率为0,东北地区役用马动脉炎阳性率为8.26%,西北地区役用马动脉炎阳性率为7.55%。鉴于此,有必要加强EVA检测,掌握EVA在我国分布,以有效的预防和控制本病传播。
- 李红梅侯玉杰时成龙郭巍胡兰赵立平相文华
- 关键词：赛马马动脉炎病毒流行病学调查
- 马流感病毒NP单克隆抗体的制备及特性鉴定
- 2011年
- 利用原核表达的马流感病毒(EIV)核蛋白(NP)为免疫原,经腹腔接种4周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经4次有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选,获得了3株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株2G11、3E10和4A1,并对它们进行了亚类鉴定、间接ELISA检测和特性鉴定。结果显示,单抗2G11为IgG1亚型,3E10为IgG2a亚型,4A1为IgM亚型,轻链均为κ链。单抗2G11、3E10和4A1的细胞上清液及腹水效价分别为1∶640、1∶640、1∶320和1∶409 600、1∶204 800、0。这3株单抗均能特异性识别EIV NP重组蛋白,并且能够与天然EIV结合;获得的3株单抗与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马乙型脑炎病毒均不发生交叉反应。亲和力试验结果显示,单抗2G11和3E10与EIV的亲和力常数分别为4.39×106 M-1和2.20×106 M-1。
- 姬媛媛郭巍王征赵立平李红梅相文华
- 关键词：马流感病毒核蛋白单克隆抗体
- 应用TaqMan荧光定量PCR检测H3N8亚型马流感病毒被引量：5
- 2009年
- 为建立马流感病毒(EIV)的检测方法,本试验针对H3N8亚型EIV血凝素(HA)基因高度保守序列设计并合成了2对引物和1条TaqMan荧光探针,建立了TaqMan荧光定量PCR方法。经用TaqMan荧光定量PCR、RT-PCR和病毒分离方法分别检测新疆等省135份疑似EIV马鼻拭子样品,其结果表明:3种方法的马流感检出率分别为54.07%、37.78%、0.89%;TaqMan荧光定量PCR可检出马流感病毒基因组RNA的灵敏度可达10拷贝/反应,而且与其他马呼吸道病毒均无交叉反应,具有良好的特异性、敏感性和重复性。该方法为H3N8亚型马流感的早期诊断及分子流行病学调查等提供了一种新的快速、准确的定量检测技术。
- 戴伶俐郭巍李雪峰黄文强赵立平阿依吐拉.肉孜相文华
- 关键词：TAQMAN探针荧光定量PCRH3N8亚型马流感病毒
- 马流感诊断方法研究进展与应用概况被引量：10
- 2010年
- 马流行性感冒（简称马流感），是由正粘病毒科A型流感病毒中的马流感病毒（Equine influenza virus，EIV）H7N7亚型和H3N8所引起马属动物的一种急性高度接触传染性疾病。该病的临诊特征为发烧，结膜潮红，咳嗽，流浆液性鼻液、脓性鼻漏及母马流产等。马群一旦感染EIV，极易大范围迅速传播，
- 戴伶俐李雪峰相文华
- 关键词：马流感病毒A型流感病毒流行性感冒正粘病毒科VIRUS
- H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究被引量：1
- 2010年
- 目的研发一种具有良好免疫原性的H3N8型马流感血凝素(hemagglutinin,HA)核酸疫苗。方法根据马A型流感病毒A/Equine/Xinjiang/3/08(H3N8)的HA蛋白序列,经密码子优化后化学合成能够表达相应蛋白的基因片段,并将该片段克隆到核酸疫苗载体pJW4303中,构建带有天然信号肽的H3HA核酸疫苗,命名为H3HA/XJ3-08-wt;进一步对HA基因进行修饰,以人组织纤维蛋白酶原激活剂(human tissue plasminogen activator,tPA)取代H3HA天然信号肽,命名为H3HA/XJ3-08-tPA,或切除部分HA的基因片段使之只表达HA蛋白的胞外域,命名为H3HA/XJ3-08-dTM。用这3种重组质粒分别转染293T细胞,蛋白表达经蛋白质印迹检测得到确认。采用电转录法免疫新西兰白兔。ELISA方法检测免疫后兔血清中抗H3HA抗体滴度,血凝抑制实验(hemagglutination inhibition,HI)检测保护性抗体水平。结果 3种H3HA核酸疫苗均可在293T细胞中高效表达,并能够在新西兰白兔体内诱导产生特异性抗H3HA抗体,HI检测到不同水平的保护性抗体。其中以H3HA/XJ3-08-tPA的免疫原性最强。结论新构建的H3N8型马流感血凝素核酸疫苗具有良好的免疫原性,为此类疫苗的进一步研发奠定了基础。
- 许莹郭巍王世霞黄文强张璐卢山周建华相文华黄祖瑚
- 关键词：血凝素类
- 马疱疹病毒1型SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立被引量：8
- 2012年
- 为建立马疱疹病毒Ⅰ型(EHV-1)的检测方法,本研究以EHV-1 gB基因的一段保守区域(1 207 bp～1 509 bp)作为检测的目的片段设计引物,通过对其反应条件的优化,建立了特异性检测EHV-1的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。实验结果表明:该方法检测目的基因的灵敏度下限为10拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;与马疱疹病毒4型(EHV-4)及其他马传染病病原体无交叉反应;组内及组间的变异系数均小于2%。该方法检测速度快及高敏感性的特点为马鼻肺炎的防制提供了有力保障,同时也为进一步开展马鼻肺炎相关的研究提供了有效的辅助检测方法技术。
- 王征郭巍姬媛媛曲娟娟赵立平李红梅相文华
- 关键词：SYBR荧光定量PCR
- 马流感病毒NP基因的原核表达及其抗原性分析被引量：1
- 2010年
- 采用RT-PCR方法从马流感病毒中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)中扩增了NP基因片段,将其克隆到表达载体pET-30a(+)中,测序验证后转化入表达宿主菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌表达出约64ku、以可溶性形式存在的重组融合蛋白,且在0.2mmol/L IPTG条件下诱导6h表达效果最好。表达产物经镍柱纯化后得到纯度较高的目的蛋白。经Western-blot和间接ELISA分析,纯化的蛋白只与抗马流感病毒阳性血清发生特异性反应,证实该蛋白具有良好的反应原性和特异性。
- 姬媛媛郭巍相文华
- 关键词：马流感病毒NP基因原核表达抗原性
