国家高技术研究发展计划(2007AA100605)
- 作品数：12 被引量：87H指数：5
- 相关作者：伍宁丰初晓宇田健谢春芳姚冬生更多>>
- 相关机构：中国农业科学院生物技术研究所暨南大学广东省生物工程药物重点实验室更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划广东省产业技术研究与开发资金计划项目广东省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学环境科学与工程更多>>
- DNA甲基化作用的生物学功能被引量：21
- 2009年
- DNA甲基化作为DNA序列的修饰方式,是一种重要的表观遗传机制,能够在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因组的功能,在生命活动中起着重要的作用。其功能主要可归结为以下4个方面:维持基因组遗传物质的稳定性,调控基因的表达,建立表观遗传模式以及参与细胞及胚胎的形态建成。
- 郑小梅伍宁丰
- 关键词：DNA甲基化DNA甲基转移酶表观遗传印迹基因
- 黄曲霉毒素氧化酶的酶动力学研究被引量：4
- 2012年
- 黄曲霉毒素氧化酶(AFO)是来自Armillariella tabescens的具有降解黄曲霉毒素作用的蛋白质酶.本实验室成功克隆和以原核系统表达了黄曲霉毒素氧化酶,前期的工作中用传统测量表观酶促反应速度的方法对AFO进行了酶动力学的研究,采用了在酶反应的结束点进行分析,因此不能够连续监测酶的反应过程,且实验过程较为繁琐,影响因素较多,对动力学常数的测量存在不够准确的可能.本实验使用等温滴定微量热技术对该酶的酶促动力学进行研究,该方法通过酶与底物的滴定实验直接监测酶反应过程中的热量变化而对酶动力学进行分析,滴定产生一个完整的Michaelis-Menten曲线,通过拟合分析测得黄曲霉毒素氧化酶对AFB1催化的米氏常数KmAFB1=3.34×10-7mol/L;酶催化ST反应的米氏常数KmST=1.06×10-7mol/L.对AFB1和ST酶转换系数别为KcatAFB1=2.7 min-1和KcatST=1.7 min-1.结合函分别为ΔHAFB1=-1.686×107 J/mol,ΔHST=-9.092×106 J/mol.与传统方法相比,ITC方法在酶动力学研究上具有简便、快速和准确的优点并具有普适性.
- 胡丽莎谢春芳刘大岭
- 关键词：酶动力学
- 通过正交实验设计突变体组合提高甲基对硫磷水解酶OPHC2对乙基对硫磷的降解能力
- 2010年
- 分别自假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenesC2-1)和假单胞菌(Pseudomonassp.1-7)中克隆得到甲基对硫磷水解酶基因ophc2和ophc3,其编码甲基对硫磷水解酶OPHC2和OPHC3的氨基酸序列相似性达98.5%,仅5个氨基酸残基不同,但酶学性质差异很大,特别是对不同底物降解特性有很大差异。OPHC2对甲基对硫磷的催化效率是OPHC3的2.75倍,对乙基对硫磷的催化效率仅为OPHC3的12.9%。为了提高OPHC2对乙基对硫磷的降解活性,以OPHC3的序列为依据,针对5个不同的氨基酸设计正交实验,对OPHC2进行组合突变,最终获得了一个突变体P165S/A169V,对乙基对硫磷的催化效率是OPHC2的1.19倍,对甲基对硫磷的催化效率是OPHC2的1.36倍。
- 吕红田健初晓宇伍宁丰
- 关键词：甲基对硫磷水解酶正交实验定点突变
- 有机磷污染土壤和活性泥中有机磷降解酶基因和微生物多样性研究被引量：3
- 2009年
- 采用珠磨法直接从受有机磷污染的土壤和活性泥样品中提取和纯化宏基因组DNA。根据有机磷降解酶基因保守区设计引物,从宏基因组中扩增有机磷降解酶基因片段。回收扩增产物后,构建了以pEASY-T3为载体的有机磷降解酶基因片段文库。从文库中随机挑选克隆进行DNA序列测定,并分析测序结果,评价有机磷污染土壤和活性泥中有机磷降解酶基因的多样性和新颖性。结果显示,88%土壤来源序列与GenBank中同类酶序列相似性在44%-65%之间,97%活性泥来源序列与GenBank中同类酶的相似性在23%-77%之间,且序列多样性极为丰富,显示在有机磷污染土壤和活性泥中含有丰富和新颖的有机磷降解酶基因资源。同时采用PCR-DGGE的方法对有机磷污染土壤和活性泥中微生物多样性进行了初步研究。
- 赵宇许丽田健初晓宇伍宁丰
- 关键词：土壤PCR-DGGE
- 来源于假单胞菌4-硝基酚降解基因簇中的偏苯三酚1,2-双加氧酶基因克隆和功能鉴定被引量：2
- 2009年
- 通过富集培养的方法从农药厂废水曝气池的活性污泥中筛选到了一株既具有甲基对硫磷降解活性又可以有效降解4-硝基酚的高效菌株1-7,经16S rDNA鉴定为假单胞菌(Pseudom onassp.)。根据4-硝基酚降解相关基因保守区设计简并引物扩增小片段,再应用TAIL-PCR克隆得到偏苯三酚1,2-双加氧酶基因dio1,基因全长873 bp,编码290个氨基酸,酶蛋白理论分子量为32.8 kDa。doi1基因在E.coliBL21中过量表达,并通过N i-NTA亲和层析纯化,结果表明该酶具有正常的生物学活性,证明了假单胞菌1-7可以通过偏苯三酚途径降解4-硝基酚。初步探讨了假单胞菌1-7的4-硝基酚降解机制。
- 孙雯许丽张双宇田健初晓宇伍宁丰
- 关键词：甲基对硫磷4-硝基酚假单胞菌TAIL-PCR
- 基于易错PCR的黄曲霉毒素解毒酶体外分子定向进化被引量：11
- 2011年
- 运用定向进化-易错PCR方法,提高黄曲霉毒素解毒酶的活力及稳定性,并结合辣根过氧化物酶(HRP)-隐性亮绿(RBG)快速高通量筛选系统,构建了库容约为104的突变体库。经过两轮易错PCR,最终分别获得了耐高温70℃突变酶A1773、pH 4.0稳定性的突变酶A1476,pH 4.0和pH 7.5均表现稳定性的突变酶A2863,其酶活力比野生酶分别提高了6.5倍、21倍和12.6倍。经序列分析表明,发现突变酶A1773发生了Glu127Lys和Gln613Arg突变;突变酶A2863发生了Gly73Ser、Ile307Leu、Val596Ala、Gln613Arg突变;突变酶A1476发生了Ser46Pro、Lys221Gln、Ile307Leu和Asn471Ile突变。结果为进一步了解黄曲霉毒素解毒酶的结构与功能之间的关系提供了参考。
- 张赛邢克克胡亚冬谢春芳刘大岭姚冬生
- 关键词：黄曲霉毒素解毒酶稳定性定向进化易错PCR
- rADTZ在大肠杆菌中的可溶性融合表达、纯化及其圆二色性分析
- 黄曲霉毒素是一类强致癌诱变剂,其毒性大,稳定性高,对人类和动物的危害较大,其中黄曲霉毒素B是毒性最强的一种。该毒素的转化、去毒一直是受到关注的问题。本研究所已运用基因工程技术获得了该黄曲霉毒素解毒酶(Aflatoxin-...
- 胡熔谢春芳刘大岭姚冬生
- 文献传递
- 3种DNA提取方法对养殖池塘不同生境菌群PCR-DGGE分析的影响被引量：10
- 2009年
- 比较3种DNA提取方法(溶菌酶法、CTAB法及珠磨法)对养殖池塘几种生境(底泥、饲料、草鱼肠道内容物及肠道壁)菌群PCR-DGGE分析的影响。结果表明,以3种提取方法获得的DNA为模板均能进行16SrDNA V3区特异性片段扩增;但不同DNA提取方法对池塘不同生境菌群DGGE指纹图谱存在显著影响。DGGE指纹图谱显示草鱼肠道内容物菌群(溶菌酶法)与肠道壁菌群(溶菌酶法)存在较高一致性,底泥菌群(CTAB法)及饲料菌群(溶菌酶法)与鱼体肠道菌群(包括内容物菌群和肠道壁菌群)则存在明显差异,但肠道菌群与底泥菌群的相似度相对更高。研究提示采用微生物分子生态学工具对养殖池塘不同生境进行菌群结构分析时,需提前优化DNA提取方法;在以投饲为主的养殖鱼塘中,草鱼肠道菌群更多源自于池塘底泥。
- 何夙旭周志刚姚斌白东清
- 关键词：养殖池塘菌群PCR-DGGE
- 一种新的氧化酶的研究
- ＜正＞氧化还原酶在生物体内的新陈代谢中起着关键作用,参与细胞的能量代谢。它们在化学工业、医药工业以及食品加工工业上是一类重要的生物催化剂。氧化还原酶催化剂具有较好的选择性、可控性和经济性,一直是生物有机化学家所感兴趣的。...
- 姚冬生
- 文献传递
- 一种酿酒酵母附加型分泌表达载体pYES2/CT/α-factor的构建及鉴定被引量：3
- 2009年
- 以pPIC9为模板,通过PCR扩增获得酿酒酵母的α-交配因子(α-factor),并克隆至酿酒酵母胞内表达载体pYES2/CT中,构建了一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体pYES2/CT/α-factor(pYCα)。再将甘露聚糖酶基因(mannase,man)通过酶切、连接克隆至pYCα的α-factor的下游,构建了pYCα-man重组载体检验pYCα的分泌性能和稳定性。结果显示α-factor可引导甘露聚糖酶基因在胞外分泌表达,在曲利本兰培养基上形成明显的水解圈,进一步分析重组菌胞外和胞内酶活,结果显示对照INVSc1/pYCα的两种酶活都未检测到,而INVSc1/pYCα-man具有明显的胞外酶活,未检测到胞内酶活,说明构建的pYCα具有良好的分泌性能;稳定性实验表明重组质粒连续培养150 h仍具有良好的稳定性。
- 胡亚冬姚冬生
- 关键词：酿酒酵母信号肽分泌表达
