博士科研启动基金(E510C4)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
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- 利用SYBR Green real-time PCR方法监控鸡外周血淋巴细胞中马立克病毒的载量被引量：3
- 2013年
- 建立基于SYBR GreenⅠ的real-time FQ-PCR方法检测并定量鸡外周血淋巴细胞(peripheral blood leukocytes,PBLs)中马立克病毒(Mareks disease virus,MDV)的载量(以meq基因为定量标准),并将此技术的敏感性与标准PCR方法进行对比。应用PCR技术从MDV-1攻毒后的霞烟鸡PBLs中扩增MDVmeq基因的部分片段,纯化上述基因的DNA扩增产物,然后克隆到pGM-T载体,重组质粒通过PCR和EcoRⅠ酶切及测序分析进行确认;将浓度梯度的meq基因的重组标准品质粒DNA进行real-time FQ-PCR,建立其相应的标准曲线。同样以质粒DNA为模板,real-time FQ-PCR方法的最低检出率为10拷贝,而标准PCR的最低检出率则为32拷贝。结果表明,在检测MDV时,real-time FQ-PCR敏感度比标准PCR要高。
- 金元昌韦平袁志栋李玉峰
- 关键词：马立克病毒外周血淋巴细胞FQ-PCRMEQ基因
- 鸡BF1和BF2基因实时荧光定量PCR检测方法的建立
- 2013年
- 目的建立鸡主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)BF1和BF2基因实时荧光定量PCR[Real-time fluorescent quantitative(FQ)-PCR]检测方法。方法从鸡外周血淋巴白细胞(Peripheral blood leuk-ocytes,PBLs)中提取细胞总RNA,以其为模板,根据BF1、BF2和GAPDH基因相对保守序列各设计一对引物,应用RT-PCR法扩增目的基因,分别克隆至pGM-T载体上,制备重组质粒标准品,经PCR、EcoRⅠ酶切及测序鉴定;优化反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立Real-time FQ-PCR检测方法,并验证其敏感性、特异性及重复性。结果重组质粒标准品经PCR、酶切及测序鉴定构建正确;建立的定量标准曲线临界循环数(Threshold cycle,Ct)与BF1、BF2和GAPDH起始质粒DNA拷贝数的对数之间线性关系良好,相关系数分别为1.00、0.98、0.99,扩增效率分别为0.8、1.1、1.1;该方法的敏感性可达101copies/μl;融解曲线分析表明扩增效率一致,特异性较好;质粒DNA标准品3次检测的CV值误差不超过0.5,均小于5%。结论已成功建立了鸡BF1和BF2基因实时荧光定量PCR检测方法,为下一步应用该法检测BF1和BF2基因的转录水平奠定了基础。
- 金元昌李玉峰袁志栋
- 关键词：主要组织相容性复合体实时荧光定量PCR
