国家重点基础研究发展计划(2003CB114201)
- 作品数：45 被引量：317H指数：11
- 相关作者：孙明张杰喻子牛宋福平黄大昉更多>>
- 相关机构：华中农业大学中国农业科学院植物保护研究所中国农业科学院生物技术研究所更多>>
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- 苏云金芽胞杆菌幕虫亚种晶胞粘连现象与晶体蛋白基因cry26 Aa所在质粒有关被引量：2
- 2007年
- 苏云金芽胞杆菌幕虫亚种T02菌株的伴胞晶体在芽胞外壁内侧形成,呈现晶胞粘连的现象。在此菌株中克隆了cry26 Aa和cry28 Aa两个基因,并对晶胞粘连现象与质粒的相关性做了系统研究。通过消除幕虫亚种T02菌株的质粒,得到了仅消除cry26 Aa所在质粒的菌株BMB1151和无质粒的菌株BMB1152。通过穿梭载体将cry26 Aa和cry28 Aa两个基因分别和同时转化无质粒突变株BMB1152并表达,形成的晶体与芽胞独立存在不能粘连,表明在幕虫亚种染色体背景下仅仅cry的表达不能形成晶胞粘连现象,从而推断晶胞粘连现象可能与幕虫亚种两个基因所在的质粒有关;进一步的研究发现将cry26 Aa在仅消除cry26 Aa所在质粒的突变株BMB1151中表达,形成的晶体与芽胞也分别独立存在不能粘连,从而进一步推断幕虫亚种晶胞粘连现象与cry26 Aa所在质粒有关。
- 鞠守勇纪芳朱自敏喻子牛孙明汤治国张睿
- 关键词：苏云金芽胞杆菌
- 苏云金芽胞杆菌cry26Aa和cry28Aa基因共表达可在芽胞外壁内侧形成伴胞晶体被引量：2
- 2005年
- 苏云金芽胞杆菌幕虫亚种的伴胞晶体在预芽胞外壁内侧形成,呈现晶体芽胞粘连的现象。根据已发表的cry26Aa1和cry28Aa1基因序列设计引物,从苏云金芽胞杆菌幕虫亚种T02中扩增得到cry26Aa和cry28Aa基因,通过穿梭载体将这两个基因分别和同时转化到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,透射电镜下可在芽胞外壁内侧和外侧同时观察到伴胞晶体,而单独表达时可在芽胞外壁外侧观察到伴胞晶体。结果表明,伴胞晶体在芽胞外壁内侧表达不单独依赖于启动子的时空调控,可能还受到晶体蛋白相互作用的影响。
- 张睿赵昌明喻子牛孙明
- 关键词：苏云金芽胞杆菌
- 利用S-层蛋白在细胞表面展示α-淀粉酶和金属硫蛋白被引量：8
- 2004年
- 选用苏云金芽胞杆菌CTC菌株细胞表面S 层蛋白作为表面展示载体 ,利用其N 端信号肽以及锚定序列分别将不同生物特性的外源蛋白带到胞外并锚定在细胞的表面。为研究外源蛋白的分子量和生化特性对表面展示以及对其在细胞表面生物活性的影响 ,选用分子量较大的分泌性蛋白α 淀粉酶和富含半胱氨酸的非分泌性蛋白金属硫蛋白作为目标蛋白。将α 淀粉酶的结构基因 (amy)和金属硫蛋白的结构基因 (smtA)与S 层蛋白的锚定区slh结合 ,构建融合蛋白基因slh amy及slh smtA ,克隆至穿梭载体pHT30 4上 ,得到重组质粒pBMBSA 30 4和pBMBSM 30 4 ;转入带有帮助质粒的重组菌株BMB171 pBMB CSA中 ,得到新的重组菌株BMBSAC和BMBSMC。SDS PAGE显示融合蛋白SLH AMY和SLH SMTA在重组菌的表面得到了表达。利用锥虫蓝染色 打孔加膜法表明重组菌SAC的确具有表面酶活性 ,α 淀粉酶被固定在细胞表面。碘液法测定的数据表明重组菌SAC的菌悬液样品较之受体菌BMB171菌悬液样品酶活提高了 4 2 4 %。Ni NTA 琼脂糖微球吸附试验显示重组菌SMC能够被微球所吸附 ,证实SMTA在重组菌表面具有活性。对游离镉离子的吸附试验显示重组菌对镉离子的吸附能力是对照受体菌的 4倍。
- 吴怀光刘欣孙明喻子牛
- 关键词：苏云金芽胞杆菌S-层蛋白细胞表面展示融合蛋白Α-淀粉酶
- 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ba3活性区的研究被引量：7
- 2005年
- 通过对Cry1Ba3蛋白序列的分析,以及与已知Cry蛋白比较,设计了6对特异性引物,通过PCR扩增获得6种不同长度的cry1Ba3基因片段。将这些基因片段克隆到pET-21b载体上,导入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,最终得到6种不同长度的Cry1Ba3蛋白片段。采用浸叶法检测这些蛋白片段对小菜蛾的杀虫活性,研究结果表明含有第1～685位和含有第22～655位氨基酸的蛋白片段对小菜蛾的毒性,与全长Cry1Ba3蛋白相比,没有改变;含有第54～655位氨基酸的蛋白片段对小菜蛾的毒力明显降低;而含有第22～627位和含有第85～655位氨基酸的蛋白片段完全丧失了对小菜蛾的活性。上述结果表明Cry1Ba3蛋白对小菜蛾的活性区在第22～655位氨基酸之间。
- 王广君张杰吴隽宋福平黄大昉
- 关键词：苏云金芽孢杆菌小菜蛾杀虫晶体蛋白基因片段特异性引物PCR扩增
- Bt杀虫蛋白基因cry8Ea2的克隆、表达和活性被引量：8
- 2008年
- 根据已知Btcry8类基因的全长序列设计一对特异性引物JJX5和JJX3,以Bt菌株B-DLL的质粒DNA为模板扩增出3.5 kb大小的片段;将该片段插入大肠杆菌表达载体pET-21b中,并完成了该片段的全序列测定。该基因编码区为3 495 bp,编码的蛋白质由1 164个氨基酸残基组成,相对分子质量为131.8 kDa,等电点为pH 4.71,为弱酸性蛋白。该基因(GenBank:EU047597)编码的氨基酸序列与Cry8Ea1的氨基酸序列同源性高达99.31%,被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry8Ea2。经IPTG诱导后该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达130 kDa的蛋白,表达产物对暗黑鳃金龟、琉璃弧丽金龟和柳蓝叶甲具有活性,在浓度为8.98μg/g时对暗黑鳃金龟、琉璃弧丽金龟一龄幼虫14 d的校正死亡率分别为46.67%和55.56%;在浓度为89.8μg/mL时对柳蓝叶甲三龄幼虫96 h的校正死亡率为33.33%。
- 刘兴龙程林友李天龙李长友李国勋
- 关键词：BT基因克隆蛋白表达杀虫活性
- 苏云金芽胞杆菌基因工程菌BMB696B对实验动物的安全性评估被引量：2
- 2006年
- 将来自苏云金芽胞杆菌李氏亚种的营养期杀虫蛋白基因vip83导入苏云金芽胞杆菌高毒菌株YBT 1520,得到广谱、高毒的工程菌BMB696B。室内生物测定显示该工程菌对棉铃虫和甜菜夜蛾具有很高的毒力。然而,国内外还未见有关于营养期杀虫蛋白的毒理学资料的报道,因此工程菌BMB696B的毒理学安全性也无法预测。为了对该工程菌的安全性进行合理的评价,并为该产品的生产和应用过程中安全防护措施的制定提供依据,根据国家标准GB 15670—1995《农药登记毒理学试验方法》,就BMB696B粉剂对实验动物进行了相关的毒理学试验。结果表明,工程菌对Wistar大鼠急性经口LD50大于5 000 mg/kg,急性经皮LD50大于2 000 mg/kg,均属低毒类;对兔皮肤刺激平均指数72 h后为0,皮肤刺激强度为无刺激性;眼刺激平均指数48 h后为0,眼刺激强度为无刺激性;对豚鼠致敏率为0,属I级弱致敏物。由此证明,工程菌BMB696B没有经口和经皮的急性毒性、没有急性皮肤和眼刺激性、没有致敏性。
- 彭东海陈守文阮丽芳李林喻子牛孙明
- 关键词：微生物学苏云金芽胞杆菌基因工程菌生物农药安全性评估毒理学试验
- 苏云金芽胞杆菌G03 spoIVF操纵子敲除对芽胞和晶体形成的影响被引量：6
- 2007年
- spoIVF是一个普遍存在于芽胞杆菌中的操纵子。在枯草芽胞杆菌中,它编码的两个蛋白是芽胞形成所必需的。采用基因重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌G03菌株中的spoIVF操纵子,构建了spoIVF缺失株G03(spoIVF-)。研究表明:该突变株丧失了形成芽胞和晶体的能力。lacZ基因与cry1Aa基因的启动子融合表达分析发现:突变株中的cry1Aa基因的活性严重降低。利用载体pSTK携带spoIVF操纵子在突变株中的表达,使突变株部分恢复了产胞和形成杀虫晶体蛋白的能力。这说明spoIVF操纵子是所必需的,同时该操纵子还影响σE因子控制的cry1Aa基因表达。
- 孙长坡宋福平张杰黄大昉
- 关键词：苏云金芽胞杆菌芽胞晶体
- 苏云金杆菌-δ内毒素作用机理及抗性研究进展被引量：5
- 2006年
- 文章在分子水平上介绍了苏云金杆菌作用机理及其在中肠作用靶标—中肠上皮细胞刷状缘膜(BB-MV)受体的研究进展;害虫产生抗性是由多个因素引起的,从受体和蛋白酶活性两个主要方面阐述了害虫对Bt产生抗性的机理;简要的介绍了害虫抗性治理的基本策略。
- 张怀江李长友程林友盖树鹏郑桂玲李国勋
- 关键词：苏云金杆菌抗性
- 根癌农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系的研究被引量：10
- 2006年
- 本研究以潮霉素抗性基因为选择标记,建立了根癌农杆菌介导的花魔芋(Amorphophalluskonjac)的遗传转化体系。同时探讨了魔芋愈伤组织的培养基、筛选剂和筛选时间等因素对转化效率的影响。通过筛选时间不同的两个转化试验,分别从300个花魔芋愈伤组织中得到了16个和18个具有潮霉素抗性的愈伤组织,其抗性愈伤率为5.33%和6.00%。获得的抗性愈伤组织进一步在分化培养基上进行分化,其分化效率分别为31.2%和22.2%。移栽后,分别得到了39株和36株成活植株。PCR检测表明分别有26株和21株再生花魔芋出现了800bp的特异性扩增带型,其阳性率分别为66.7%和58.3%。随机挑取20个PCR阳性植株的DNA进行斑点杂交检测,结果表明外源基因已经整合到花魔芋的基因组中。
- 周盈林拥军柴鑫莉孙明
- 关键词：花魔芋根癌农杆菌遗传转化体系
- 融合基因在转基因植物中的应用被引量：3
- 2007年
- 目前双基因和多基因转基因植物已经商品化,并展现了广泛的应用前景。但在转基因植物研究中,使多个基因同时在植物体中表达调控依然很难实现,是植物基因工程和生物技术发展中的难点。融合基因表达载体作为一种新型的方法,弥补了获得双价或多价转基因植物传统方法的缺点,具有更高的应用价值。对目前构建融合基因的方法作了评述,并对比较新颖的连接肽2A和LP4作了详细介绍。
- 李艳萍郎志宏李敏李国勋黄大昉
- 关键词：融合基因植物基因工程
