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排序方式：

盐藻hsp70a cDNA片段的克隆与分析被引量：10: 2003年; 根据衣藻、矮牵牛花、Pisumsativum等真核生物hsp70a氨基酸高度保守序列设计两对简并引物,以热休克盐藻cDNA为模板进行巢式PCR扩增,产物经T A克隆转化至JM109大肠杆菌中,经筛选后测序,将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析,获得了盐藻热休克蛋白70acDNA片段。在盐藻中所获得的cDNA片段,核苷酸长度为372bp,编码126个氨基酸。推导的氨基酸序列与与下列物种的hsp70a比较:衣藻为96%,矮牵牛花为94%,Pisumsativum为86%,番茄为86%,人为85%,果蝇和酵母分别为84%和83%。所克隆的序列为盐藻hsp70acDNA片段。; 姜国忠牛向丽吕玉民谢华王建民袁保梅徐培荣薛乐勋; 关键词：杜氏盐藻 CDNA 克隆

转基因微藻作为新型生物反应器的研究进展被引量：1: 2006年; 转基因微藻作为生物反应器生产生物活性物质已成为基因工程研究的热点之一。目前以转基因微藻作为生物反应器的技术并不十分成熟,然而许多科研人员及生物医药公司将微藻作为新型生物反应器生产有用的外源蛋白。本文对微藻生物反应器构建中的有效核转化方法的建立、转基因微藻中所用的启动子、筛选标记、稳定表达等问题进行了综述,同时介绍了目前转化成功的以及未来可能转化成功的有潜在应用价值的微藻。; 刘红涛鲁照明侯桂琴李慎柯王建民薛乐勋; 关键词：生物反应器启动子

小鼠canstatin cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达被引量：3: 2004年; 目的 :从小鼠肝脏组织克隆canstatincDNA并在大肠杆菌 (E .coli)中表达 ,为进一步研究其抗肿瘤血管生成活性奠定基础。方法 :用Trizol试剂提取小鼠肝脏组织总RNA ,通过RT -PCR扩增小鼠canstatin(mcanstatin)的cDNA ,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将小鼠canstatincDNA定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中 ,在大肠杆菌E .coliBL2 1中经IPTG诱导表达。结果 :小鼠canstatin的cDNA长度为 6 84bp ,编码 2 2 7个氨基酸 ,与已知的人canstatin的cDNA同源性为 89% ,氨基酸的同源性为 96 %。IPTG诱导原核表达载体pET30a(+) /mcanstatin在大肠杆菌E .coliBL2 1中表达。结论 :首次成功克隆了小鼠canstatin的cDNA ,其原核表达载体pET30a(+) /mcanstatin在大肠杆菌E .coliBL2 1中高效表达 ,小鼠canstatin抗肿瘤血管生成活性有待进一步研究。; 侯卫红袁保梅王天云柴玉荣侯桂琴王建民薛乐勋; 关键词：CDNA克隆血管生成抑制剂原核表达

重组人纤溶酶原Kringle1-5的制备及其生物学活性被引量：5: 2005年; 为了研究重组人纤溶酶原Kringle15(K15)的抗血管生成活性及其对内皮细胞增殖的影响,通过PCR扩增人纤溶酶原K15cDNA,定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体pETK15,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE和Western杂交检测K15的表达。鸡胚尿囊膜(CAM)实验和MTT实验分别检测重组人纤溶酶原Kringle15对鸡胚新生血管生成和内皮细胞的抑制作用。结果表明,IPTG诱导原核表达载体pETK15在E.coliBL21(DE3)中的表达量约占菌体总蛋白量的32%,K15主要以包涵体形式存在,包涵体经过洗涤、溶解、Nispin亲合柱层析纯化以及蛋白质复性等步骤后,获得了纯度约为96%的重组K15蛋白。CAM实验表明,原核表达的重组人K15能有效地按剂量依赖的方式抑制鸡胚新生血管的形成。MTT实验结果显示,重组人K15特异地抑制内皮细胞的增殖,而对非内皮细胞无抑制作用。; 侯卫红柴玉荣王天云王建民贾岩龙薛乐勋; 关键词：KRINGLE 纤溶酶原肿瘤血管生成抑制剂血管抑素原核表达

微藻异养产生二十碳五烯酸的新进展: 2004年; 二十碳五烯酸 (Eicosapentaenoicacid简写EPA)是一种长链多不饱和脂肪酸 ,在营养强化、防治心血管疾病、减轻炎症等方面起着十分重要的作用。目前EPA主要来源于鱼油 ,很难满足市场对EPA日益增长的需求 ,必须寻求替代生产EPA的资源。一些微藻可在不需要光的条件下以廉价的有机物为原料异养生长 ,在异养条件下 ,可以很好地控制培养模式 ,有可能大规模地生产EPA。工业上用微藻生产EPA研究包括 :筛选高EPA产量的微藻株 ,通过基因工程改善藻株 ,优化培养条件以及建立有效的培养体系。本文综述了近几年微藻在异养条件下生产EPA的最新进展。; 刘红涛胡志军侯桂琴王建人薛乐勋; 关键词：二十碳五烯酸多不饱和脂肪酸微藻硅藻异养影响因素

信号肽-canstatin真核表达载体的构建及其在Eca-109细胞中的分泌表达: 2006年; 目的:构建信号肽-canstatin真核表达载体并在人食管癌细胞Eca-109中分泌表达。方法:利用点突变技术将小鼠纤溶酶原信号肽(SP)序列插入到载体pEGFP-C1 EGFP编码序列起始密码的后面,构建pEGFP-C1-SP载体。以pMD18T-Can为模板,扩增小鼠canstatin基因,构建信号肽-canstatin分泌型真核表达载体pEGFP-C1-SP-Can。用脂质体转染法瞬时转染人食管癌细胞Eca-109。利用W estern b lotting检测小鼠canstatin融合蛋白在Eca-109细胞中的分泌表达。结果:DNA测序证明所构建的带信号肽的中间载体pEGFP-C1-SP正确;酶切和DNA测序表明信号肽-canstatin分泌型真核表达载体pEGFP-C1-SP-Can构建正确,EGFP-cansta-tin融合蛋白在人食管癌细胞Eca-109中分泌表达。结论:获得了能分泌canstatin融合蛋白的真核表达载体,并分泌到人食管癌细胞Eca-109的细胞外,为小鼠canstatin的功能研究及应用于基因治疗提供了实验基础。; 侯卫红田芳王建民王志超陈华艳薛乐勋; 关键词：CANSTATIN 血管生成抑制剂 ECA-109细胞

一种高特异性的改良降落PCR(英文)被引量：8: 2002年; 为提高基因组DNA中的基因PCR检出的特异性,设计了一种改良的降落PCR程序,并分别用TaqDNA聚合酶及高保真PfuDNA聚合酶进行实验.自盐藻Dunaliellabardawil中提取基因组DNA作为PCR模板,使用TaqDNA聚合酶及PfuDNA聚合酶,运用普通PCR和降落PCR程序,扩增胡萝卜素生物合成相关基因(cbr)上游启动子序列,并电泳比较PCR扩增产物的特异性.结果显示,使用普通Taq酶PCR,普通PCR程序产生200bp,500bp和1272bp长的三条带,而TD PCR程序仅克隆出1272bp的特异带;利用高保真的PfuDNA聚合酶作PCR,在TD PCR泳道中仅有1272bp一条带,而普通PCR除了1272bp的特异带外,还出现一条500bp的非特异带.无论使用普通Taq酶或高保真酶Pfu,改良的降落PCR程序均明显提高PCR的特异性,类似的降落PCR程序可望用于克隆用普通PCR难以克隆的基因片段,或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性.; 张贵星袁保梅许培荣王建民薛乐勋; 关键词：高特异性

小鼠canstatin C端片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达被引量：1: 2005年; 为了构建小鼠canstatin C端片段的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatin C端片段(mCan-C)基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将mCan-C基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET/ mCan-C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明,小鼠canstatin C端片段的cDNA 长度为399bp,含有1个终止密码,编码132个氨基酸,与已知的人canstatin C端片段氨基酸的同源性为61%。IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E.coli BL21中表达,表达量约占菌体总蛋白量的28%,重组蛋白主要以包涵体形式存在。首次克隆了小鼠canstatin C端片段的cDNA,IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E.coli BL21中高效表达。小鼠canstatin C端片段的cDNA序列已收入GenBank,接受号为:AY502947。; 侯卫红田芳王建民王天云柴玉荣陈华艳薛乐勋; 关键词：CANSTATIN C端片段基因克隆大肠杆菌原核表达内源性血管生成抑制因子

盐藻胞浆hsp70 cDNA的克隆及其mRNA的诱导表达被引量：4: 2005年; 用cDNA末端快速扩增方法克隆得到了一个2652bp的盐藻(Dunaliellasalina)胞浆hsp70cDNA全长,编码着650个氨基酸残基的多肽。推导的氨基酸序列有2个ATP酶结合位点和一个多肽结合区。由克隆得到的盐藻cDNA推导的氨基酸序列,经GenBankblast后与数据库中胞浆hsp70序列一致。与莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、人、小麦(Triticumaestivum)和啤酒酵母(Saccharomyces.cerevisiae)胞浆hsp70的序列一致性分别为83%、80%、81.5%和80.5%。Northern印迹显示,90min后,mRNA量在40℃热休克时是光诱导时的3倍。光诱导则使hsp70mRNA积累相对迟缓。结果表明,所克隆得到的hsp70基因蛋白产物定位在盐藻细胞浆中,光诱导和热休克均可以使hsp70mRNA水平明显增高,但以热休克为显著。; 姜国忠许培荣牛向丽王建民袁保梅薛乐勋; 关键词：HSP70 热休克光诱导

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河南省科技攻关计划(0122032500)

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