广东省科技计划工业攻关项目(2007B031001004)
- 作品数：3 被引量：6H指数：1
- 相关作者：曾春刘斌戎利民蔡道章董健文更多>>
- 相关机构：中山大学附属第三医院更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目中山大学医科青年教师科研启动基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 密度梯度离心与贴壁筛选法体外分离培养胎儿骨髓间充质干细胞被引量：5
- 2009年
- 背景:胎儿骨髓间充质干细胞与成人相比,具有更好的自我更新和分化能力,以及更低的免疫原性。目的:选择更适应胎儿骨髓间充质干细胞体外分离培养的方法。设计、时间及地点:单一样本细胞学观察,于2005-06/12在中山大学附属第三医院中心实验室完成。材料:16～24周胎龄的流产胎儿由中山大学附属第三医院妇产科提供,产妇及家属均签署知情同意书。方法:无菌条件下截取流产胎儿双侧四肢骨,PBS冲洗髓腔,离心去脂肪及上清液,L-DMEM重悬细胞,沿管壁缓慢滴加至底部有等量1.073g/mLPercoll分离液的离心管中,离心后吸取中间界面白膜层,加入含体积分数为10%的胎牛血清、青霉素钠、链霉素的L-DMEM完全培养基,接种后置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱内培养。48h后换液,去除未贴壁细胞,以后每2d换液一次。待细胞达到80%～90%融合时,胰酶-EDTA消化传代。主要观察指标:倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态;透射电镜观察细胞超微结构;流式细胞技术检测其表面标记物;碱性磷酸酶染色检测成骨分化能力;Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测成软骨分化能力。结果:原代及传代培养的胎儿骨髓间充质干细胞呈梭形外观,具有较强的增殖能力。胞体较小,细胞核/浆比例大,胞核呈圆形或椭圆形,胞浆少,染色质较疏松,表现出早期细胞的特点,传至第20代细胞超微结构仍无明显改变。细胞表面抗原CD29,CD44,CD105呈阳性表达,CD34,CD45呈阴性表达。骨髓间充质干细胞诱导分化后,碱性磷酸酶染色及Ⅱ型胶原均呈阳性。结论:利用密度梯度离心+贴壁筛选法可成功分离培养胎儿骨髓间充质干细胞,所获细胞能够向成骨细胞及软骨细胞分化,该方法为体外培养扩增胎儿骨髓间充质干细胞的简单、稳定、高效的手段。
- 刘斌戎利民董健文曾春蔡道章
- 关键词：胎儿骨髓间充质干细胞
- rAAV2-hTGF-β1转染犬MSCs诱导分化为软骨细胞的研究
- 2009年
- 目的探讨rAAV2-hTGF-β1体外转染犬MSCs定向分化为软骨细胞的可行性。方法应用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养犬MSCs。倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态．流式细胞技术鉴定其表面标记物。取第三代MSCs，分别以感染复数（MOI）为1×10^5病毒基因数／细胞（v.g／cell）、5×10^5v．g．／cell的rAAV2-hTGF-β1进行转染。培养后定期取各组细胞进行相关检测。Western blot检测hTGF—β1的表达，ELISA法测定hTGF—β1的含量。RT-PCR检测Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA的表达，免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原的表达。结果原代及传代培养的MSCs呈梭形外观，具有较强的增殖能力。细胞表面抗原CD29、CD44、CD105表达阳性，CD34、CD45表达阴性。rAAV2-hTGF-β1转染MSCs后，Western blot法检测到目的蛋白hTGF—β1稳定表达；ELISA法检测转染组MSCs培养上清液中的hTGF-β1表达，且随时间的延长，各组hTGF—β1浓度逐渐增加，MOI5×10^5组表达量明显高于MOI1×10^5组（P〈0．01）；RT—PCR检测到各转染组Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA表达，免疫细胞化学法检测转染组细胞Ⅱ型胶原呈阳性表达，且高MOI值组表达强度明显高于低MOI值组。结论rAAV2-hTGF—β1转染犬MSCs后可定向分化为软骨细胞，作为软骨组织工程的种子细胞是可行的。
- 刘斌蔡道章戎利民董健文曾春史德海张非
- 关键词：腺相关病毒软骨细胞
- 不同血清型腺相关病毒介导的增强绿色荧光蛋白转染犬骨髓间充质干细胞的比较被引量：1
- 2009年
- 间充质干细胞（MSCs）具有多向分化潜能，增殖能力强，是组织工程种子细胞研究热点之一。腺相关病毒（AAV）载体是已知可整合在染色体上长期表达而不致病的病毒载体。为明确AAV1与AAV2载体对MSCs的转染特点和表达效率，我们就rAAV载体介导的增强绿色荧光蛋白（EGFP）对体外培养犬MSCs的转染情况进行了观察。
- 刘斌蔡道章戎利民王昆曾春谢沛根宋炎成
- 关键词：骨髓间充质干细胞转染病毒介导组织工程种子细胞多向分化潜能
