国家高技术研究发展计划(2013AA102804)
- 作品数：9 被引量：28H指数：3
- 相关作者：伍宁丰田健初晓宇余小霞刘晓青更多>>
- 相关机构：中国农业科学院生物技术研究所河北农业大学暨南大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金江苏省研究生培养创新工程项目更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 枯草芽胞杆菌芽胞表面展示外源蛋白的研究进展被引量：13
- 2013年
- 枯草芽胞杆菌是一种生物安全的革兰氏阳性细菌,在营养匮乏的环境下,可形成具有强抗逆性的芽胞。枯草芽胞杆菌的芽胞由核心、皮层、孢子外套蛋白三部分组成,目前已成功利用枯草芽胞杆菌芽胞外套蛋白CotB、CotC、CotG、CotX和OxdD为载体,将酶蛋白、抗原蛋白或荧光标记蛋白等展示于芽胞表面。芽胞表面展示的蛋白通常具有较好的稳定性、易于纯化和安全性好等优点,可应用于医药、食品及饲料工业等领域,具有较大的应用前景。详细介绍了枯草芽胞杆菌芽胞的分子特点及芽胞表面展示系统的构建过程及其应用前景,为芽胞表面展示载体的基础及应用研究奠定基础。
- 余小霞田健伍宁丰
- 关键词：枯草芽胞杆菌芽胞外源蛋白
- 来源于枯草芽孢杆菌的漆酶cotA基因克隆与表达及其酶学性质研究被引量：6
- 2015年
- 漆酶作为一种含铜离子的多酚氧化酶,在环境保护、生物能源、食品工业和纸浆漂白等工业中有重要的应用价值。从枯草芽孢杆菌168菌株中克隆漆酶cot A基因,全长1 542 bp,编码513个氨基酸,外加一个终止密码子。将该基因在大肠杆菌Transetta(DE3)菌株中通过微好氧发酵法进行异源表达和纯化,获得的重组酶蛋白Cot A的最适反应温度为60℃,最适p H为4.5。该酶在60℃具有较好的热稳定性,保温90 min后仍有71.70%的剩余酶活。最适反应条件下,重组酶对ABTS的Km为63.9±5μmol/L,kcat为39.1±1/s,最大反应速率为0.005μmol/L·min·mg,且在最适反应条件下,微好氧发酵法获得的重组酶蛋白Cot A的比活(557.8 U/mg)是低温诱导法(0.2 U/mg)的2 655.4倍。因此,通过微好氧发酵法可以显著提高重组漆酶Cot A的比活力。
- 余小霞刘晓青田健伍宁丰
- 关键词：漆酶基因克隆
- 热稳定性对甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌的影响被引量：1
- 2015年
- 甲基对硫磷水解酶可生物降解有机磷农药,由于其特殊的应用价值,越来越受到人们的关注。来源于苍白杆菌的甲基对硫磷水解酶MPH-Och在毕赤酵母系统中不能有效地分泌表达。将热稳定性提高的突变体MPH-S274Q在毕赤酵母中表达,发现其毕赤酵母重组菌株经摇瓶诱导培养120 h后,培养上清的酶活力达到0.7 U/m L,蛋白分泌量是野生型的14倍,SDS-PAGE电泳图中培养上清有明显的蛋白质条带,进一步证明了分泌效率提高,该结果表明提高蛋白质的热稳定性可以作为提高外源蛋白在毕赤酵母中的分泌效率的一条有效途径。
- 龚攀范家佑田健伍宁丰初晓宇
- 关键词：甲基对硫磷水解酶分泌热稳定性毕赤酵母
- 来源于土壤宏基因组中漆酶Lac13H9基因克隆及其酶学性质分析被引量：1
- 2015年
- 漆酶广泛存在于土壤中,在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。从土壤宏基因组中得到了一个全长为1 389 bp漆酶基因lac13H9,编码462个氨基酸,预测理论分子量为50 k Da,含有一个17个氨基酸组成的信号肽,与NCBI蛋白数据库比对结果表明是一个新的漆酶基因。将lac13H9转入到大肠杆菌Transseta(DE3)中通过微好氧发酵进行异源表达,并通过Ni柱亲和层析纯化。获得的重组漆酶Lac13H9具有良好的酶学性质,其最适温度为40℃,最适p H为6.0,且具有较好的热稳定性,在50℃下保温90 min还有60%的剩余酶活力,同时发现低浓度的Fe2+促进漆酶酶活,高浓度则抑制酶活。良好的酶学性质为该酶的应用奠定了基础。
- 胡斌斌吴萍刘晓青丁伟伍宁丰
- 关键词：漆酶基因克隆酶学性质
- 细菌氟抗性研究进展被引量：5
- 2013年
- 氟离子对多种细菌如变形链球菌、氧化硫硫杆菌和中度嗜热嗜酸菌等细菌具有抑制和杀伤作用。氟离子杀菌机制包括:破坏细胞膜的结构、影响细胞的ATPase活性、抑制多种代谢酶如烯醇酶等。细菌对氟离子的抗性机制包括:将无机氟离子转化为有机氟离子,由氟化物核糖开关控制相关蛋白表达和逆向运输蛋白EriCF对氟离子的运输等。目前关于微生物对氟离子的抗性方面的研究很少,因此,分离并确定与细菌耐氟相关基因的功能,研究其耐氟的机制,对深入理解细菌对氟的抗性以及细菌对阴离子的抗性机制有着重大的理论意义,同时也为解决一些需要在高氟环境下发挥功能的细菌的生长问题以及更好的利用氟离子来杀死有害菌等应用问题奠定良好的基础。
- 刘丽慧田健伍宁丰
- 关键词：细菌
- Rhodococcus sp.T1菌株胞内精恶唑禾草灵酯酶酶学性质及分离纯化被引量：1
- 2015年
- [目的]Rhodococcus sp.T1是一株高效的精恶唑禾草灵（FE）降解菌株,T1菌株可以断裂FE的酯键将其转化为精恶唑禾草灵酸（FA）。对T1菌株胞内精恶唑禾草灵酯酶的酶学性质进行研究并对其进行分离纯化,以期为生物修复精恶唑禾草灵污染提供更多的理论依据。[方法]以酯酶的通用底物乙酸-1-萘酯作为定量测定胞内酯酶活力的底物,分析温度和p H值对酯酶活力和稳定性的影响,同时探讨金属离子对酯酶活力的影响;通过硫酸铵沉淀、疏水层析、DEAE离子交换层析和Superdex-200凝胶层析柱组合技术对精恶唑禾草灵酯酶进行分离纯化,计算了纯化过程中酯酶的比活力、纯化倍数和回收率。[结果]胞内酯酶最适反应p H值为8.0,在p H 4.0-10.0内处理24 h活性稳定;最适反应温度为42℃,在温度50℃以下处理30 min活性稳定;1.0 mmol·L^-1Ag^＋对酯酶活力有强烈的抑制作用。纯化后的酯酶比活力从0.058 U·mg^-1提高到21.5 U·mg^-1,纯化倍数为369.5倍,回收率为3%。纯化后的粗酶经SDS-PAGE电泳后至少有4条明显的蛋白条带,通过酶谱确定精恶唑禾草灵酯酶条带的相对分子质量为42.3×10^3。[结论]精恶唑禾草灵酯酶具有较好的酸碱稳定性和热稳定性,在精恶唑禾草灵污染土壤修复中可能具有较好的应用潜力。
- 董维亮侯颖王飞李周坤黄彦崔中利
- 关键词：RHODOCOCCUS精恶唑禾草灵分离纯化酶学性质
- 漆酶N端融合His-tag或S-tag标签促进其在大肠杆菌中可溶性表达被引量：2
- 2016年
- 来源于地衣芽孢杆菌的漆酶具有催效率高,底物范围广等优点在工农业等领域具有重要的应用前景,但该酶在外源基因表达系统中的表达量低,影响了其在工农业等领域的应用。His-tag和S-tag两种标签由于具有分子量小,且一般不影响外源蛋白性质等特点,在外源蛋白的纯化和检测中具有重要的应用。本研究发现将来源于地衣芽孢杆菌的漆酶Cot A的N端融合Histag或S-tag构建于p ET-22b载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3)后可以显著提高其在大肠杆菌中的可溶性表达量,其表达量较N端无融合标签的构建,His-tag可提高漆酶表达量约为37倍,S-tag约可提高20倍,His-tag与S-tag共作用约可提高28倍。
- 岳青霞张丽洁田健伍宁丰姚冬生
- 关键词：漆酶HIS-TAG
- 特异腐质霉来源漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达
- 2019年
- 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。从特异腐质霉Y1(Humicola insolens Y1)中分离到了漆酶基因Lac1,其全长1 803 bp,编码600个氨基酸,与NCBI蛋白数据库比对结果表明,与来源于Chaetomium globosum CBS 148.51(XP_001228806)的多酚氧化酶序列相似性最高为71%,表明是一个新的漆酶基因。将其克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9r中,通过PCR和SDS-PAGE检测证实基因已经整合入酵母基因组中且能分泌表达。在3 L发酵罐中,重组Lac1蛋白表达量达到3.79mg/mL发酵液,酶活性达到1.3 U/mL发酵液。酶学性质分析结果显示,漆酶的最适作用温度为65℃,最适反应pH为4.5,且在pH 6～11的范围内酶的相对活力均在70%以上。
- 张丽洁徐欣欣田健初晓宇朱宝成伍宁丰
- 关键词：漆酶基因克隆异源表达毕赤酵母
- 启动子及信号肽筛选提高普鲁兰酶在地衣芽孢杆菌中的表达
- 2019年
- 普鲁兰酶(pullulanase)是一种淀粉脱支酶,在淀粉糖化加工等工业生产中具有重要的应用价值。选用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) BL10作为表达宿主,为了提高其中的普鲁兰酶产量,对来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 168和地衣芽孢杆菌BL10中的15种不同信号肽以及4种不同启动子进行筛选,构建了不同的重组工程菌株,最终发现在以P43为启动子、apr为信号肽的条件下,上清液中普鲁兰酶的表达量最高,酶活可达12 U/m L,且测得其最适反应温度为60℃,最适p H为4.5。结果表明通过对启动子及信号肽进行筛选是提高重组工程菌株中目的蛋白表达量的一种有效手段。
- 王倩初晓宇初晓宇朱宝成
- 关键词：地衣芽孢杆菌普鲁兰酶启动子信号肽
