广州市科技计划项目(2006Z3-E4011)
- 作品数：3 被引量：9H指数：2
- 相关作者：胡凤玉郑小凌周红娟胡旭初徐劲更多>>
- 相关机构：中山大学杭州市红十字会医院广州医学院更多>>
- 发文基金：广东省重大科技专项广州市科技计划项目国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因的克隆表达和重组蛋白的免疫学分析被引量：3
- 2008年
- 目的对新发现的华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因进行克隆、表达和免疫学初步研究。方法将华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因(去除了信号肽编码序列)克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白免疫SD大鼠制备抗血清。用蛋白印迹(Western blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能识别感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清,表明具有免疫反应性。结论华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。
- 赵俊红胡旭初徐劲胡凤玉周红娟胡慧霞郑小凌李艳文余新炳
- 关键词：华支睾吸虫组织蛋白酶D天冬氨酸蛋白酶免疫原性
- 华支睾吸虫F_0-ATP合酶b亚基基因的克隆表达和重组蛋白的免疫原性分析被引量：5
- 2007年
- 目的对华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基(CsF0-ATP-synt_B)基因进行克隆、表达及重组蛋白的免疫原性分析。方法以华支睾吸虫成虫cDNA文库中含有F0-ATP合酶b亚基基因的质粒为模板,扩增该基因(去除线粒体靶向序列的成熟肽基因),将其克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基硫代-!-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经亲和层析获得的纯化表达产物免疫SD大鼠,制备抗血清。蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫原性。结果华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基成熟肽基因的编码区含813个碱基,编码271个氨基酸,相对分子质量(Mr)为31171.9。经亲和层析获得的重组蛋白可被其免疫的大鼠血清识别。结论华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达。
- 周红娟胡旭初胡凤玉徐劲马长玲郑小凌陈晓湘余新炳
- 关键词：华支睾吸虫基因克隆原核表达免疫原性
- 华支睾吸虫ATP合酶b亚基的组织和亚细胞定位被引量：2
- 2009年
- 目的了解华支睾吸虫ATP合酶b亚基(CsATP-synt_B)的虫体组织定位,并以HeLa细胞为替代模型观察其亚细胞定位。方法用CsATP-synt_B重组蛋白免疫SD大鼠,取其抗血清对华支睾吸虫成虫石蜡切片进行间接免疫荧光染色,观察CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫成虫组织中的分布。根据生物信息学预测的CsATP-synt_B线粒体转运序列(MTS序列)和核定位序列(NLS序列)位置,设计4组引物[CsATP-synt_B全长序列,以及3个缺失突变体(MTS-缺失线粒体转运序列、NLS-缺失核定位序列、MTS-NLS-线粒体-核定位双缺失)引物],扩增出全长基因和3个突变体基因,构建重组质粒pEGFP-N1-CsATP-synt_B1-300、pEGFP-N1-CsATP-synt_B30-300、pEGFP-N1-CsATP-synt_B(1-238)+(257-300)及pEGFP-N1-CsATP-synt_B(30-238)+(257-300)。将这些重组质粒用阳离子脂质体转染HeLa细胞,48h后用激光共聚焦显微镜观察CsATP-synt_B全长基因和3个突变体在HeLa细胞的表达和亚细胞定位。结果CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫成虫中分布较为广泛,主要分布在腹吸盘、卵巢、卵黄腺和皮层。绿色荧光蛋白GFP表明CsATP-synt_B全长序列表达于线粒体或细胞核,线粒体转运序列缺失突变体表达于细胞核,核定位序列缺失突变体表达于线粒体,双缺失突变体仅表达于胞浆。结论CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫的分布与线粒体的分布一致,主要集中在能量代谢较旺盛的组织部位。CsATP-synt_B蛋白既可进入线粒体,也可进入细胞核,理论预测的定位序列得到证实。
- 胡旭初周红娟胡凤玉马长玲赵俊红黄灿郑小凌徐劲余新炳
- 关键词：华支睾吸虫免疫组织化学亚细胞定位
