哈尔滨市科技创新人才研究专项资金(2008RFQXS017)
- 作品数：10 被引量：35H指数：5
- 相关作者：任桂萍李德山田辉徐黎明王文飞更多>>
- 相关机构：东北农业大学黑龙江省医院中国水产科学研究院黑龙江水产研究所更多>>
- 发文基金：哈尔滨市科技创新人才研究专项资金黑龙江省教育厅资助项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 嗜中性粒细胞是人抵抗素表达的主要细胞被引量：5
- 2011年
- 抵抗素(resistin)是小鼠白色脂肪组织大量表达的富含半胱氨酸的分泌型蛋白.近年研究发现,人与啮齿类动物的抵抗素组织表达分布存在很大差异.小鼠抵抗素主要在白色脂肪组织表达,而人抵抗素主要在单核细胞/巨噬细胞表达,且在骨髓组织中大量表达,但目前骨髓中的细胞定位还不清楚.本研究的目的是明确成人骨髓及外周血白细胞中抵抗素表达细胞的类型.免疫荧光法检测骨髓中抵抗素表达细胞,结果显示,抵抗素主要表达在细胞核呈杆状和分叶核状的成熟粒细胞中,其中杆状核粒细胞表达较高,分叶核粒细胞表达减弱.Anti-hresistin IgG-Biotin-PE单色荧光流式细胞术分选外周血白细胞中抵抗素表达细胞后经瑞氏化学染色,结果显示,抵抗素表达细胞主要为杆状和分叶核状的嗜中性粒细胞,还有少量嗜酸性粒细胞,且抵抗素蛋白分布在细胞质中.RT-qPCR结果在RNA水平上证明,人抵抗素在嗜中性粒细胞中大量表达.Anti-hresistin IgG-FITC和anti-HNL IgG-Biotin-PE双色荧光流式细胞术进一步证明,抵抗素的主要表达细胞为成熟的嗜中性粒细胞.嗜中性粒细胞在机体免疫防御中起重要作用,人骨髓及外周血中抵抗素主要在成熟嗜中性粒细胞中表达,这一研究结论为人抵抗素与炎症反应的关联性及其功能的进一步研究奠定了基础.
- 高振秋张巧徐彤田辉任桂萍李璐刘向宇李德山
- 关键词：骨髓外周血嗜中性粒细胞
- 可溶性重组hTRAIL蛋白抑制U251细胞生长
- 2011年
- 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是TNF超家族中的成员,能够广泛诱导肿瘤细胞凋亡,对正常细胞无明显毒副作用.TRAIL已成为肿瘤治疗领域的研究热点.人脑胶质瘤是神经系统肿瘤中最常见类型,占颅内肿瘤50%～60%,5年存活率为20%～30%.本研究探讨可溶性TRAIL蛋白对人脑胶质瘤细胞(U251)的抑制作用.由大肠杆菌表达系统表达的TRAIL多为包涵体,为获得可溶性的蛋白,将hTRAIL95～281功能区基因片段插入到pHisSUMO表达载体,经IPTG低温诱导表达,Ni-NTA Agarose纯化后获得可溶性SUMO-hTRAIL,经SUMO ProteaseⅠ切去SUMO融合标签后获得成熟可溶hTRAIL蛋白.以U251细胞为靶细胞,通过MTT法检测TRAIL对肿瘤细胞的抑制作用.结果证明,TRAIL对U251细胞的抑制呈剂量依赖关系,最大抑制率为53.9%.流式细胞仪检测TRAIL诱导U251细胞凋亡实验中,对照组细胞存活率为92.2±0.8%,实验组细胞存活率为35.5±1.2%,证明重组蛋白具有生物学活性,并在体外能明显诱导U251肿瘤细胞发生死亡.本研究结果为TRAIL蛋白在临床上应用于肿瘤治疗奠定了基础.
- 颜世君吴云舟高振秋叶贤龙张巧何金娇任桂萍李德山
- 关键词：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体SUMO肿瘤治疗
- 新型抗IL-1β和IL-17A双特异抗体的构建及特性鉴定被引量：2
- 2011年
- 目的双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb）具有双重的生物学功能。本实验旨在设计并原核表达抗人IL-1β和抗人IL-17A的双特异性抗体（BsAb1／17），获得具有生物活性的BsAb1／17，为深入研究和利用双特异性抗体奠定基础。方法利用重叠PCR方法构建VH1VL17-CL和VL1VH17-CH1基因片段，并且在所用引物的5’和3’端附加NcoI和BamHI的酶切位点。将重叠PCR产物进行胶回收后用NcoI／BamHI进行双酶切，酶切产物再次胶回收，将其连接到用NcoI／BamHI消化的pET-27b载体上。将重组质粒pET-27b—VH1VL17-CL（petA）和pET-27b—VLIVH17-CH1（petB）转化到Eco1iRosetta中。SDS—PAGE和Westernb1ot进行鉴定，用rea1—timePCR检测其阻断IL-1β刺激人T细胞表达细胞因子IL-1β的活性，人IL-6定量酶联检测试剂盒检测其阻断IL-17A刺激HeLa细胞表达人IL-6的活性。结果DNA测序结果证明成功构建了pET-27b-VHIVL17-CL（petA）和pET-27b-VL1VH17-CH1（petB）表达质粒。petA、petB诱导产物主要以包涵体形式存在，成熟蛋白纯化产物纯度超过90％以上，经SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量约为38×10^3，与理论值相符。Western b1ot和ELISA结果证实双特异抗体BsAb1／17对IL-1β和IL-17A均具有很好的亲和力。通过RT-PCR检测证明其具有阻断IL-1β刺激人T细胞大量表达细胞因子IL-1β的活性，并且具有阻断IL-17A刺激HeLa细胞产生IL-6的活性。结论成功构建了同时抗IL-1β和IL-17A的双特异抗体，并利用大肠杆菌表达系统高效表达较高纯度的具有生物活性的双特异抗体。
- 王秋颖徐黎明任桂萍彭中宜丁良君孙阳陈睿李德山
- 关键词：双特异性抗体原核表达
- 筛选Fab抗体库的细菌展示技术的建立被引量：7
- 2011年
- 目的:利用NlpA蛋白的前六个氨基酸(CDQSSS)将抗体锚定在细菌内膜建立筛选Fabs抗体库的展示技术,为今后抗体的研发工作奠定基础。方法:从pNAD质粒中克隆出NlpAleader(含有CDQSSS序列)基因序列,利用相应的酶切位点将该序列插入pComb3表达载体中构建成用于展示Fab的重组质粒pBFD。将从pEAI质粒克隆得到的anti-human IL-1β抗体的重链Fab和全长轻链分别插入到NlpAleader和pelBleader(pComb3载体自带的果胶酶基因前导肽)的下游。将pBFD-Fab转入到E.coli DH5α中诱导表达,原生质球制备后,采用梯度浓度的抗原进行孵育,最后经流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况并且分选阳性群体,利用质粒提取的方法来替代PCR方法拯救阳性基因,转化E.coli DH5α,利用FCM再次检测该群体展示的抗体与抗原结合情况。结果:所展示的anti-hIL-1β Fab抗体依次与抗原和FITC标记的抗原特异性抗体孵育后,用FCM实时检测,结果显示出很强的荧光信号并且表现出抗原浓度依赖性。拯救出的pBFD-Fab-原生质球的FCM检测结果与首次展示的FCM结果一致,该系统能够稳定的展示抗体。结论:经过该细菌展示系统展示的Fab抗体能够有效的折叠,与相应的抗原具有很好的特异性结合能力。成功改进该展示技术的基因拯救方法,避免了基因突变和链置换的发生。此外还证明了该展示技术具有很好的稳定性。本实验成功构建了筛选Fab抗体库的细菌展技术。
- 徐黎明尹成凯任桂萍田辉王雪琴丁良君李德山
- 关键词：FAB抗体库
- 人抵抗素基因表达与白血病发病的相关性研究被引量：1
- 2009年
- 抵抗素(resistin)自2001年被发现以来,人们对其生物学功能尚不清楚。本研究目的是通过抵抗素的组织表达分布以探讨人抵抗素的生物学功能、表达及与白血病发病的相关性。选择152例无炎症并发症的白血病病人作为实验组,100例健康志愿者作为对照组,采集静脉血血样,采用半定量PCR方法检测抵抗素在组织中的表达分布并比较抵抗素与内参基因表达的相对值,进行统计学分析。结果表明:抵抗素在正常人骨髓、胎儿肝脏,脐带血以及外周血细胞中有高水平表达,而在脂肪、脐带、胎盘以及成人肝脏组织中尚没有扩增出目的基因。实验发现,实验组抵抗素表达率为21%,对照组抵抗素表达率为27%,经卡方检验,χ2=0.84,差异不显著。对实验组与对照组抵抗素表达水平比较结果进行了统计学分析,差别无统计学意义(p>0.05)。结论:抵抗素在正常人骨髓、胎肝、脐血及外周血细胞中有高表达,此结果表明人抵抗素的表达与正常造血相关,但其表达率和表达水平与白血病无明显相关性。
- 吴桐任桂萍徐彤张薇高振秋颜世君洪珞珈赵红丽李德山
- 关键词：抵抗素造血系统白血病
- 基于流式细胞术的scFv抗体库筛选技术的建立被引量：2
- 2013年
- 目的利用NlpA前导肽诱导抗体锚定细菌内膜建立筛选scFv抗体库的展示技术,为高亲和力抗体的筛选奠定基础。方法从pNAD质粒中克隆出NlpA前导肽基因序列,酶切后将该序列克隆进pHEN1表达载体中。以PEAI质粒为模板,利用PCR的方法克隆得到抗-hIL-1β抗体的重链可变区和轻链可变区基因,然后利用重叠PCR的方法构建得到抗-hIL-1βscFv抗体。将scFv抗体插入到NlpA leader-pHEN1表达载体中构建成展示scFv的重组质粒pBSD-scFv。将pBSD-scFv转入到E.coli DH5α中诱导表达,原生质球制备后,采用梯度浓度的抗原进行孵育,最后经流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况并且分选阳性群体,利用质粒提取的方法来替代PCR方法拯救阳性基因,转化E.coli DH5α,利用FCM再次检测该群体展示的抗体与抗原结合情况。结果所展示的抗-hIL-1βscFv抗体依次与抗原和FITC标记的抗原特异性抗体孵育后,用FCM实时检测,结果显示出很强的荧光信号并且表现出抗原浓度依赖性。拯救出的pBSD-scFv-原生质球的FCM检测结果与首次展示的FCM结果一致,该系统能够稳定的展示抗体。结论经过该细菌展示系统展示的scFv抗体能够有效的折叠,与相应的抗原具有很好的特异结合能力。
- 徐黎明任桂萍尹杰超田辉李德山
- 人FGF-21基因的克隆、表达及其调节脂肪细胞糖代谢的活性被引量：7
- 2010年
- 成纤维细胞生长因子FGF-21是FGF家族的一个新成员,最近的研究发现其具有调节血糖的作用,有望成为治疗2型糖尿病的基因药物。文章应用RT-PCR技术,从成人肝脏中克隆人源的FGF-21成熟蛋白基因,并将其克隆到T载体上,经测序鉴定后,将其亚克隆到原核表达载体pSUMO上,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中。鉴定阳性克隆后,用IPTG诱导FGF-21表达,并用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化。以3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖吸收实验来鉴定FGF-21表达产物促进糖吸收的活性。结果表明,FGF-21成熟蛋白基因大小为546bp,测序结果与GenBank数据库中的序列一致。SDS-PAGE与Western blotting结果表明:人源FGF-21成熟蛋白大小19.4kDa,经3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖吸收实验验证其具有促进葡萄糖吸收的生物活性,并且GLUT1是FGF-21发挥生物学作用的终末执行单位。
- 侯玉婷李晋南任桂萍刘铭瑶孙国鹏王文飞李德山
- 关键词：成熟蛋白糖尿病
- scBsAb1/17双特异性抗体对小鼠类风湿性关节炎模型的治疗效果被引量：5
- 2013年
- 目的比较不同剂量scBsAb1/17对Ⅱ型胶原(CII)诱导类风湿性关节炎(CIA)模型小鼠的治疗效果,及scBsAb1/17双特异性抗体与单价抗体(anti-IL-1βscFv和anti-IL-17scFv)在CIA模型小鼠中的治疗效果。方法利用CII建立小鼠类风湿性关节炎模型,小鼠成模后开始治疗,每2 d给药1次,治疗29 d。治疗结束后对小鼠关节炎指数进行临床评分,检测各组小鼠血清中CII抗体、CII特异性刺激的脾细胞增殖指数和脾脏中IL-2、IL-1β、IFN-γ、IL-6和TNF-α等细胞因子的表达水平。结果与CIA模型对照组相比,所有治疗组都能明显减轻CIA小鼠的临床症状,并明显降低血清中CII抗体水平、脾细胞增殖指数及脾脏中TNF-α、IL-6、IL-2、IL-1β和IFN-γ的表达量。相同剂量下scBsAb1/17治疗组的脾细胞增殖指数明显低于anti-IL-1βscFv治疗组(P<0.05);并且scBsAb1/17治疗组小鼠脾脏中IL-6、IL-2、IL-1β和IFN-γ的表达量明显低于anti-IL-1βscFv和anti-IL-17AscFv单独治疗组(P<0.01或P<0.05)。结论 scBsAb1/17及单价抗体对CIA模型小鼠都有治疗效果;不同剂量scBsAb1/17对CIA模型鼠的治疗效果呈剂量依赖性;相同剂量条件下,scBsAb1/17的治疗效果要优于单价抗体。
- 齐剑英郭茉叶贤龙阚方明张宇郝智超徐黎明任桂萍王文飞李德山
- 关键词：双特异抗体IL-1Β
- 错配PCR技术提高抗hIL17A单链抗体亲和力的研究被引量：5
- 2012年
- 目的:通过错配PCR技术提高1株人源化抗hIL17A单链抗体(scFv)的亲和力,为进一步开发治疗类风湿性关节炎(RA)的人源化抗体药物奠定基础。方法:本研究采用错配PCR和重叠PCR的方法,对抗体的重链、轻链可变区分别随机引入突变,并将细菌内膜展示技术和流式细胞技术(FCM)相结合进行高通量筛选,获得高亲和力突变株。由于hIL17A能刺激HeLa细胞产生白细胞介素IL-6和IL-8,因此scFv突变株经表达纯化后,利用real-time PCR技术在mRNA转录水平上检测其阻断hIL17A刺激HeLa细胞产生IL-6和IL-8的能力。结果:筛选出5株突变株,经流式细胞仪检测其中有3株亲和力与亲本相比有很大程度的提高,2株与亲本相当,而且所有突变株均保留了亲本与hIL17A的结合能力,经real-time PCR检测证明这5株突变株均有阻断hIL17A刺激HeLa细胞产生IL-6和IL-8的能力,突变株的亲和力与中和效果成正比。结论:错配PCR技术是抗体体外亲和力提高的一种可行性方法,在保证与抗原结合能力的基础上提高了其亲和力和中和活性。该实验结果为RA的靶向治疗提供了候选药物,而且也为抗体的体外亲和力的提高提供了参考方法。
- 田辉白福良徐黎明王文飞牛泽杉任桂萍李德山
- 关键词：FCMREAL-TIMEPCR单链抗体
- 酵母展示筛选scFv方法的建立被引量：7
- 2009年
- 目的:利用酵母展示技术建立筛选scFvs的技术平台,为今后从抗体库中筛选高亲和力抗体奠定基础。方法:改造pYD1载体,将其自身所带的GSLinker上下游两端突变出酶切位点,构建成pYD-x;分别将IL-1β抗体的重链与轻链可变区片段插入pYD-x中GSLinker的上下游,构建出重组质粒pYSD1。从pYSD1上PCR扩增出scFv片段,并将其插入pYD1的MCS区,构建出重组质粒pYSD2。将pYSD1与pYSD2分别转入酿酒酵母EBY100中诱导表达scFv,并用流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况。结果:经诱导后,从流式细胞仪检测结果中可以看出EBY100-pYSD1所展示的scFv与抗原结合力很弱,而EBY100-pYSD2则表现出一定强度的结合。结论:本实验证明了pYD-x载体上存在的额外的GSLinker对于抗体展示的必要性,并且成功建立了利用酵母展示载体pYD1进行scFvs筛选的技术平台。
- 尹成凯徐黎明任桂萍张巧刘向宇田辉李德山
- 关键词：SCFVGSLINKER
