北京市自然科学基金(7091006)
- 作品数：21 被引量：122H指数：8
- 相关作者：徐东平刘妍钟彦伟许智慧纪冬更多>>
- 相关机构：解放军第302医院内蒙古农业大学军事医学科学院更多>>
- 发文基金：北京市自然科学基金国家科技重大专项国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- G1764A/C1766T/T1768A三联突变对HBV核心启动子活性的上调作用研究被引量：6
- 2010年
- 目的构建乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)荧光素酶表达载体,探讨HBVCP变异对下游基因转录活性的影响。方法 2005年5月至2008年3月于解放军302医院就诊的慢性乙型肝炎(CHB)及慢加急性肝衰竭(ACLF)患者各40例,采集血清提取HBV DNA,采用巢式PCR法扩增HBVCP片段,克隆至pGEM-TEasy载体。挑选含有CP相关变异位点的质粒,经KpnⅠ/BglⅡ双酶切后,构建pGL3-CP荧光素酶真核报告质粒,并采用定点突变方法获得野生型质粒,将两者同时转染肝癌细胞系HepG2,48h后进行荧光素酶检测。结果患者临床资料经统计分析后显示,CHB患者HBeAg阳性率和HBV DNA载量均高于ACLF患者(P<0.01),而TBIL含量则低于ACLF患者(P<0.01);对CP区热点突变频率分析后发现:G1764A/C1766T/T1768A三联突变在CHB患者中为0.0%(0/40),在ACLF患者中为12.5%(5/40,P<0.05)。细胞转染结果显示:典型CP双联突变A1762T/G1764A病毒株的启动子活性为相应野生株的1.67倍,而G1764A/C1766T/T1768A三联突变病毒株的启动子活性为相应野生株的1.43～1.80倍。结论 HBeAg阳性率、TBIL水平、HBV DNA载量与乙型肝炎重症化相关,HBVCP中存在的A1762T/G1764A、G1764A/C1766T/T1768A突变有顺式激活下游基因转录活性的作用。
- 王耀刘妍许智慧纪冬李晓东钟彦伟徐东平
- 关键词：突变启动区反式激活
- 乙型肝炎病毒rtN238H变异与阿德福韦酯耐药的相关性研究被引量：2
- 2011年
- 目的阐明乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶/逆转录酶区rtN238H变异对临床产生阿德福韦(ADV)耐药的影响。方法分析了1789例慢性乙型肝炎患者rtN238H变异的发生频率及其与ADV用药的关系;从典型病例患者血清中克隆获得HBV rtN238H变异株并通过回复定点突变获得对应的野生株,分别构建pTriEx-HBV1.1重组表达载体,瞬时转染HepG2细胞。给予转染细胞不同浓度ADV处理,用DNase消化游离DNA后,对上清中成熟病毒颗粒中的HBV DNA进行裂解定量以评价病毒的复制力。结果在1789例乙型肝炎患者中rtN238H变异为181例(10.1%),其中HBV B基因型感染为151例(83.4%),C基因型感染为30例(16.6%);ADV经治和未治患者分别为130例(71.8.%)和51例(28.2%),其中对ADV治疗产生临床应答(含部分应答)的占82.3%(107/130),无应答或出现病毒学反跳的占17.7%(23/130),但与野生株相比,rtN238H变异株对ADV的敏感性和病毒复制力无明显的改变。结论 rtN238H是HBV自然发生的多态性变异,对ADV敏感性和复制力无直接的影响。
- 朱华钟彦伟许智慧刘佳慧刘妍苏何玲徐东平
- 关键词：慢性乙型肝炎乙型肝炎病毒耐药性阿德福韦
- 乙型肝炎病毒的病毒学特点及其临床意义被引量：18
- 2009年
- 乙型肝炎病毒(HBV)为嗜肝双链DNA病毒,病毒基因组特点如下:①病毒的多聚酶/反转录酶(RT)缺乏校对功能,使HBV较其他DNA病毒更易产生变异;②病毒基因组开放读码框架重叠,1个基因位点上的突变有可能同时引起2种病毒蛋白突变;③生命周期中存在稳定的共价闭合环状DNA(cccDNA);④可以整合到宿主细胞染色体DNA中;⑤病毒蛋白对某些宿主细胞基因表达具有反式调节作用。HBV的这些病毒学特点与乙型肝炎的慢性化和疾病进展密切相关。多位点检测HBVRT基因耐药突变对临床监测病毒耐药、合理进行抗病毒治疗十分重要,分析病毒基因组变异和检测cccDNA对深入了解HBV致病机制与疗效评价有积极意义。技术方法的创新与改进是进行HBV临床病毒学特点研究的基础。
- 徐东平
- 关键词：突变抗病毒药
- 1121例慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区的耐药突变分析(英文)被引量：12
- 2009年
- 目的分析大样本慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶基因上的多位点核苷(酸)类似物的耐药相关突变情况及其临床意义。方法提取1 121例患者血清HBV DNA,采用巢式PCR方法扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对12个位点上的耐药相关突变进行检测,并结合临床资料进行分析。结果检出拉米夫定(LAM)耐药突变228例,阿德福韦(ADV)耐药突变32例,恩替卡韦(ETV)耐药突变13例,替比夫定(L-dT)耐药突变4例。多药耐药5例。LAM耐药突变中以M204V和M204I最常见,前者通常伴随L180 M突变,后者常单独出现;ADV耐药突变中以N236T±A181位碱基替换为主;ETV耐药突变发生在LAM耐药基础上,以T184位碱基替换为主;L-dT的耐药突变为M204I。结论用基因序列测定法检测HBV RT基因多位点耐药相关突变,有助于临床及时发现乙肝患者是否存在HBV基因耐药,合理进行抗病毒治疗。
- 刘妍王春梅纪冬徐辰韩萍任晓强许智慧戴久增张玲霞徐东平
- 关键词：突变
- 958例乙型肝炎患者HBV前C/BCP区变异检测及其意义分析被引量：10
- 2009年
- 目的检测不同病情乙型肝炎患者HBV前C/BCP区的变异特点并分析变异的意义。方法采用巢式PCR方法扩增399例轻中度慢性乙型肝炎、211例重度慢性乙型肝炎和348例慢性重型乙型肝炎患者的HBV前C/BCP区序列,PCR产物纯化后直接测序。分析10个热点变异位点及其插入/缺失变异情况,并进行统计学分析,比较这些变异对病情进展的影响。结果随着病情的加重,T1753、A1762、G1764、C1766、T1768、G1862、G1896、G1899等8个位点变异频率显著增加(P<0.01),其中5个位点的变异发生率呈现出轻中度慢性乙型肝炎<重度慢性乙型肝炎<慢性重型乙型肝炎的阶梯式上升特点。3组患者未检出突变的比率分别为27.82%、7.58%和2.01%,呈现阶梯式下降特点。此外,前C/BCP区多联变异和插入/缺失突变的发生率在病情加重时也明显增加(P<0.01),其中三联变异率依次为轻中度慢性乙型肝炎35.34%、重度慢性乙型肝炎53.56%、慢性重型乙型肝炎67.82%。结论乙型肝炎患者HBV前C/BCP区多个位点变异与慢性乙型肝炎的重症化进程相关,对乙型肝炎重症化发生机制的研究及其临床预警分析有积极意义。
- 任晓强许智慧刘志国梁兆玲李晓东李梵毛远丽王慧芬徐东平
- 关键词：基本核心启动子
- 乙型肝炎患者HBV前S/S蛋白特异性CTL表位变异分析被引量：4
- 2009年
- 目的比较慢性重型乙型肝炎(CSHB)与慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV前S/S蛋白特异性细胞毒性T细胞(CTL)表位变异的差异,探讨乙型肝炎重症化和慢性化的机制。方法对262例乙型肝炎患者的血清样本进行HLA-A2分型;用巢式PCR扩增血清HBV前S/S基因并对PCR产物进行序列测定;根据HBV前S/S基因序列,用VirusBlast软件鉴定患者感染的HBV基因型;用VectorNTI软件对目前已知的13个HLA-A2限制性前S/S蛋白特异性CTL表位进行序列分析。结果123例(46.9%)患者HLA-A2阳性,其中CSHB71例,CHB52例。CTL表位变异分析结果如下:(1)两组间所有患者进行比较,患者S177-185和S338-347表位变异发生率有显著差异(P<0.05);(2)两组间HBVB基因型患者进行比较,患者S131-139、S183-191和S204-212表位变异发生率有极显著差异(P<0.01);(3)两组间HBVC基因型患者进行比较,CSHB组患者的S131-139表位较CHB组患者有增高(P=0.05)。结论某些HBV前S/S蛋白特异性CTL表位在CSHB与CHB患者间变异有明显差异,受病毒基因型影响,CTL表位变异可能与乙型肝炎的重症化和慢性化机制相关。
- 许智慧任晓强刘妍王耀李晓东戴久增李乐姚增涛钟彦伟徐东平
- 慢性乙型肝炎患者血清HBV全长序列分析及复制力评价被引量：7
- 2009年
- 目的分析乙型肝炎患者HBV全长基因组序列并对其复制力进行评价。方法从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV病毒DNA,PCR扩增HBV全长基因组,克隆到pGEM-Teasy载体中,每个样品挑选5～10个克隆测序,分析基因型以及全长基因组耐药相关的突变位点,并对个别位点进行定点突变。将克隆到pGEM-Teasy载体中的全长HBV基因组经BspQI/ScaI双酶切后,转染入肝癌细胞系HepG2、Huh7。转染3d后检测上清HBsAg表达量及细胞内HBV复制中间体核心颗粒DNA载量,分析全长HBV基因组的复制力(1.0倍HBV复制模型)。结果从2份慢性乙型肝炎患者血清中成功获得5条HBV全长克隆,来自同一份血清的克隆核苷酸,其一致性为98%～100%,提示HBV存在准种特性。测序结果表明5条HBV全长基因均为C型。通过定点突变又获得3个全长克隆。经序列分析发现,HBV反转录酶区存在A181V/S、L229M、V84M、M204I氨基酸位点的突变,前C/C区存在T1753C、A1762T、G1764A和G1896A核苷酸位点的突变。复制力分析提示上述位点突变后病毒复制力均有不同程度下降,L229M还可以进一步降低A181V突变株的复制力。结论自行建立的无载体1.0倍HBV复制模型可在细胞内分泌抗原蛋白以及装配子代病毒,完成生活周期,这为下一步分析HBV的耐药表型打下了基础。此外,还可指导临床制定更加合理的抗病毒策略,筛选针对已出现或将来可能出现的耐药突变的新型抗病毒药物。
- 纪冬刘妍王耀苏何玲思兰兰钟彦伟徐东平
- 关键词：DNA复制
- 慢性乙肝患者石蜡包埋肝组织中HBV cccDNA定量检测方法的建立被引量：5
- 2011年
- 目的建立慢性乙肝患者微量石蜡包埋肝组织共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)定量检测方法。方法以37例慢性乙肝患者甲醛固定石蜡包埋肝组织为研究对象,提取肝组织HBV DNA,经不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD)消化后,利用滚环扩增加跨缺口实时荧光PCR扩增技术检测肝组织中HBV cccDNA含量,以β-actin为内参照。通过已知浓度的模板DNA进行梯度稀释鉴定该方法的灵敏度,并对该方法进行批内和批间重复性检测。应用该方法分析37例慢性乙肝患者肝组织HBV cccDNA与血清总HBV DNA、肝组织总HBV DNA的关系,以及肝组织HBV cccDNA和HBV DNA与血清HBeAg表达之间的关系。结果成功建立了微量石蜡包埋肝组织HBV cccDNA的定量检测方法,该方法具有较好的特异性、灵敏度和稳定性。HBeAg阳性者肝组织中cccDNA含量明显高于HBeAg阴性者,HBV cccDNA水平与血清总HBV DNA水平(R2=0.48,P=0.042)及肝组织总HBV DNA水平(R2=0.63,P=0.001)呈正相关。结论该方法可特异灵敏地定量检测微量石蜡包埋组织切片中的HBV cccDNA。
- 韩佳琪钟彦伟任晓强邹正升刘树红刘学恩赵景民徐东平
- 关键词：乙型核酸扩增技术
- 滚环扩增在乙型肝炎病毒cccDNA检测中的应用被引量：15
- 2009年
- 目的建立慢性乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的滚环扩增(RCA)方法。方法以27例慢性乙型肝炎患者的肝组织cccDNA和血清松弛环状DNA(rcDNA)为研究对象。根据中国患者HBV基因序列特点设计4对引物,分别可与HBVcccDNA的正、负链结合。在Phi29DNA聚合酶的作用下,获得线性多拷贝cccDNA扩增产物,以该产物为模板获得cccDNA全序列;通过对模板的系列稀释鉴定RCA方法的灵敏度;以RCA产物为模板扩增肝组织cccDNA的反转录酶区基因,并与同时扩增的同时间采集的同一患者血清中的rcDNA序列进行比较。结果成功建立了HBVcccDNA全序列的RCA方法,最低可检测到10个拷贝的cccDNA分子,并获得了所有扩增cccDNA的全基因序列。27例患者中,18例患者的肝组织cccDNA和血清rcDNA反转录酶区的序列完全一致,9例患者中共检出84个不同的核苷酸位点,平均每个患者9.3个,84个不同核苷酸中只有5个引起了氨基酸的改变。结论滚环扩增方法对肝组织HBVcccDNA的检测具有较好的灵敏度。该方法的建立对深入了解cccDNA在HBV致病机制中的作用以及评价抗病毒疗效有重要意义。
- 任晓强苏何玲邹正升高峰刘立明刘妍李保森徐东平钟彦伟
- 关键词：滚环扩增共价闭合环状DNA
- 建立一种PCR产物直接测序检测HBV YMDD突变的方法被引量：2
- 2009年
- 目的建立检测HBV YMDD变异的PCR产物直接测序法，并与传统实时荧光PCR检测YMDD突变的结果进行比较分析。方法选取103份慢性乙型肝炎患者血清标本，提取血清HBV DNA。用实时荧光PCR检测YMDD突变；用巢式PCR扩增HBV逆转录酶基因，对PCR产物进行DNA双向测序，NTI软件比对结果。采用Kappa一致性检验对DNA测序法检测的rt204位点突变与实时荧光PCR检测的YMDD突变结果进行比较。结果PCR产物直接测序法可有效检测低病毒载量标本（500拷贝／m1）和高病毒载量（10^10拷贝／ml）标本，同时可以避免高病毒载量标本的抑制效应。与实时荧光PCR相比较，YIDD突变检测符合率为100％，YVDD突变检测符合率97．1％，YIDD与YVDD共生突变符合率76．2％（Kappa=0．853，P〈0．01）。结论本研究建立的PCR产物直接测序法检测HBV耐药相关基因突变，灵敏度高，检测范围宽，与实时荧光PCR检测结果有较高的符合率，并可同时检出YMDD、YIDD和YVDD。
- 许彪李晓东刘志国毛远丽胡瑾华王业东徐东平
- 关键词：肝炎病毒乙型聚合酶链反应突变
