广东省自然科学基金(04300622)
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- N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆、表达及产物纯化
- 2010年
- 目的:从猪肾中提取RNA,从中克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(GNE)基因,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达。方法:从猪肾中提取总RNA,通过RT-PCR克隆出GNE基因,经测序,感受态大肠杆菌E.coli DH5a转化,质粒抽提,鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达,通过His-tag亲和纯化(Ni Sepharose 6 Fast Flow),G-25柱脱盐,SDS-PAGE电泳检测。结果:RNA提取物经紫外分光光度计检测OD260/OD280=1.77,说明无明显的蛋白质和酚污染。RT-PCR扩增目的片段,测序证明该基因的ORF为1 206 bp,编码402个氨基酸组成的酶蛋白(GNE)。SDS-PAGE显示,纯化蛋白为45 kD的单一条带,与基因序列推测值一致。结论:GNE基因已被成功地克隆和表达。
- 余云彦张卫星闫欣欣唐琴琴刘乃华晏永波李校林绍强
- 关键词：基因克隆纯化
