国家自然科学基金(30830106)
- 作品数：11 被引量：56H指数：4
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- 腺病毒介导siRNA抑制全反式维甲酸诱导的骨髓间充质干细胞RARβ表达被引量：2
- 2012年
- 构建携带针对大鼠维甲酸受体β(Retinoic acid receptorβ,RARβ)基因的siRNA重组腺病毒,并感染全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)处理的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),检测其对RARβ的表达及MSCs成神经分化的影响。设计针对大鼠RARβ的4对siRNA的DNA序列,体外退火形成双链,定向克隆至含有U6/H1双启动子的腺病毒穿梭质粒pSES-HUS,随后与腺病毒骨架质粒pAd-Easy1在BJ5183细菌中同源重组,并在HEK293细胞中包装获得重组腺病毒Ad-siRARβ。腺病毒感染大鼠MSCs后经ATRA处理24 h,Real-time、Western blotting及免疫荧光检测RARβ的表达情况。改良神经诱导培养基(Modified neuronal induction medium,MNM)诱导MSCs神经分化,Real-time PCR及免疫荧光检测神经相关蛋白表达。PCR、酶切及测序鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,腺病毒感染大鼠MSCs后可观察到60%以上的细胞有红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)表达。经ATRA处理24 h,Real-time、Westernblotting及免疫荧光检测发现RARβ表达定位于细胞核,ATRA作用后MSCs中RARβ表达增高16.5±2.34倍(P<0.05),有3组siRNA能有效抑制ATRA诱导的RARβ表达增强,抑制率分别为(66.26±9.12)%、(48.70±5.78)%、(64.09±0.53)%(P<0.05),且以pool组效果最强,抑制率为(78.09±4.24)%(P<0.01)。ATRA联合MNM诱导MSCs成神经样细胞,表达相关神经特异蛋白Nestin、NSE、MAP-2、Tau,免疫荧光结果显示神经标志蛋白Nestin、NSE、Tju1表达阳性细胞率为(50-88)%,而腺病毒介导的siRARβ能有效抑制MSCs的神经标志物表达水平及阳性细胞率(P<0.05)。成功构建了携带针对大鼠RARβ基因的siRNA重组腺病毒,能有效感染MSCs并显著抑制ATRA诱导的RARβ表达增强和MSCs的神经分化。
- 毕杨龚敏何昀张赟陈洁李廷玉
- 关键词：腺病毒载体骨髓间充质干细胞
- 腺病毒介导siRNA抑制ATRA诱导的骨髓间充质干细胞RARβ表达
- 目的：构建携带针对大鼠RARβ基因的siRNA重组腺病毒,并感染ATRA处理的骨髓间充质干细胞(MSCs),检测RARβ的表达,为进一步研究维甲酸信号转导通路在MSCs成神经分化中的作用机制奠定重要基础.方法：设计针对大...
- 毕杨龚敏何昀张赟陈洁李廷玉
- 关键词：腺病毒MSCS
- 不同胎龄和缺氧缺血性脑病新生儿脑^(18)F-FDG PET显像的临床研究被引量：1
- 2012年
- 目的对不同胎龄新生儿及新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)患儿应用18F-FDGPET测定脑葡萄糖代谢,探讨PET测定脑葡萄糖代谢在不同胎龄新生儿中的变化及HIE中的临床应用价值。方法研究对象包括不同胎龄新生儿及HIE患儿,共计67例,其中7例因各种原因导致PET数据采集失败未纳入统计,其余60例新生儿纳入统计。其中,不同胎龄新生儿36例,包括≤32周4例,33～34周5例,35～36周12例,≥37周15例;HIE患儿24例,包括轻度13例,中度7例,重度4例。以RDSⅢ型回旋加速器获得18F后,通过自动化学合成装置制备18F-FDG溶液,在注射0.1mCi/kg18F-FDG后应用PET成像仪采集数据,并通过测定新生儿脑不同部位的标准摄取值(standardized uptake values,SUV)进行脑葡萄糖代谢半定量分析。结果比较不同胎龄新生儿18F-FDGPET脑显像,可见随着胎龄的成熟,新生儿脑葡萄糖活性呈现逐步增高的趋势,结构也变得较为清晰,尤其以胎龄达到足月新生儿标准(≥37周)后更为显著。不同胎龄新生儿脑18F-FDGPET显像的结果显示:其葡萄糖代谢活性在大脑皮层普遍较低,在丘脑则较高,其次为小脑、感觉运动皮质、基底节。胎龄≥37周的足月新生儿,其不同部位的葡萄糖代谢活性较胎龄<32周的早产儿显著增高(P<0.01)。与胎龄≥37周的足月新生儿相比,HIE患儿18F-FDGPET脑显像在所有测定的脑组织均呈现低代谢状况(P<0.05),而且,病情越重越为明显,重度HIE患儿脑葡萄糖代谢较轻、中度HIE患儿显著降低(P<0.05)。结论随着胎龄的成熟,新生儿脑葡萄糖活性呈现逐步增高的趋势,结构也变得较为清晰,尤其以胎龄达到足月新生儿标准(≥37周)后更为显著。HIE患儿PET脑显像存在明显18F-FDG代谢异常,且与病情严重程度相关。应用18F-FDGPET测定脑葡萄糖代谢为研究新生儿脑发育和损伤提供了新的方法,其临床意义值得进一步研究。
- 史源赵锦宁金榕兵唐仕芳刘蕾李廷玉
- 关键词：正电子发射断层显像术
- 出生时抗氧化维生素及重金属水平对两岁幼儿智力发育影响的相关分析被引量：14
- 2011年
- 目的 分析出生时抗氧化维生素和重金属水平与2岁时智力发育的关系,探讨早期抗氧化维生素对重金属损害智力发育的保护作用.方法 采取前瞻性队列研究,随机选取重庆远郊150对产妇及其新生儿.分别采用反相高效液相色谱法（HPLC）、AMA-254液/固相水银分析仪和PE-800 Zeeman原子吸收光谱仪测定母血和脐血维生素A、E、C及铅、镉和汞水平,对产妇问卷调查,幼儿2岁时用Gesell发育量表评估智力发育.结果 资料齐全共111对,校正混杂因素后,脐血汞水平与Gesell各能区发育商（DQ）均呈负相关（β=-0.486,β=-0.716,β=-0.846,p=-0.935,β=-0.702,P均＜0.05）;脐血维生素E水平与运动、适应、语言和平均DQ均呈正相关（β=0.475,β=0.458,β=0.403,β=0.395,P均＜0.05）.将重金属和维生素水平同时纳入回归模型后,脐血维生素E水平与运动、适应和平均DQ仍呈正相关（β=0.449,β=0.412,β=0.349,P均＜0.05）;脐血汞水平与适应、语言、个人-社会及平均DQ均呈负相关（B=-0.397,β=-0.727,β=-0.935,β=-0.628,P均＜0.05）,与运动DQ的相关性无统计学意义（P=0.0890）.维生素A和维生素c不同水平组对Gesell各能区发育商均无明显影响（P均＞0.05）;而维生素E水平＞14.8 μmol/L组各能区发育商均高于≤14.8 μmol/L组,除个人-社会发育商外,差异均有显著意义（t=2.93,t=2.06,t=2.13,t=2.27,P均＜0.05）;脐血铅水平高组,其个人-社会DQ较低（x2=5.56,P=0.015）;脐血镉水平高组,其脐血维生素C水平较低（x2=7.62,P=0.006）;脐血汞水平高组,其维生素A胎盘转运率较低（x2=8.02,P=0.005）.结论 抗氧化维生素A、E、C与重金属铅、镉、汞之间可能有交互作用,出生时抗氧化维生素在重金属对儿童早期智力发育的影响中可能具有保护作用.
- 李廷玉张萱魏小平刘永芳瞿平刘友学陈洁
- 关键词：智力测验抗氧化维生素
- ATRA Pre-induction Improves Neuronal Differentiation of Rat Mesenchymal Stem Cells And Maintains Induced Neurons Survival by Inhibiting Apoptosis
- Objective:To investigate the effect of ATRA pre-induction on neuronal differentiation of rat mesenchymal stem ...
- Yang BiMin GongYun ZhangXiaoping WeiJie ChenTingyu Li
- ATRA和9-cis-RA对缺氧缺糖损伤PC12细胞凋亡的影响被引量：4
- 2010年
- 目的探讨不同构型视黄酸[全反式视黄酸(all-trans retinoic acid,ATRA);9顺式视黄酸(9-cis-retinoicacid,9-Cis-RA)]对缺氧缺糖损伤的PC12细胞凋亡的影响,且通过何种受体途径作用。方法实验分组为:未刺激组(0μmol/L RA);1、5、10μmol/L,20μmol/L ATRA;1、5、10、20μmol/L9-CisRA。倒置显微镜观察缺氧缺糖损伤前后细胞形态变化,流式细胞术研究经不同浓度ATRA和9-Cis-RA刺激的缺氧缺糖损伤PC12细胞凋亡水平。ELISA监测ATRA和9-Cis-RA处理4 h后PC12细胞的LDH释放水平以了解其细胞膜损伤水平的差异。结果 ATRA组细胞凋亡率在1μmol/L浓度时与未刺激组无显著差异(P>0.05),从5μmol/L起随着浓度的增高凋亡率显著增高(P<0.05),在10、20μmol/L浓度组均显著高于相同浓度的9-Cis-RA组(P<0.05)和未刺激组(P<0.05);而9-Cis-RA在20μmol/L组凋亡率低于未刺激组,但无显著性差异(P>0.05)。乳酸脱氢酶(LDH)释放水平在ATRA刺激组从5μmol/L起随浓度的增高而显著性增高(P<0.01),在5、10、20μmol/L浓度均显著高于未刺激组和9-Cis-RA组(P<0.05),而在各浓度9-Cis-RA组与未刺激组均无显著性差异(P>0.05)。在RA信号系统中ATRA特异激活retinoic acid receptors(RARs),而9-Cis-RA同时激活RARs和retinoid X receptors(RXRs)。结论在缺氧缺糖损伤的PC12细胞ATRA可通过激活RARs受体途径发挥促凋亡效应,但这种效应可以被激活RXRs受体途径而抑制。
- 江伟温恩懿龚敏瞿平毕杨张赟魏小平刘友学陈洁李廷玉
- 关键词：全反式视黄酸PC12细胞缺氧缺糖凋亡
- 体外诱导微环境对骨髓间充质干细胞成神经分化的影响及分化后的自发逆转现象被引量：1
- 2010年
- 目的体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)成神经分化,并探讨诱导微环境对其分化的影响及分化后的自发逆转现象。方法体外分离培养大鼠MSCs,流式细胞仪检测细胞表面标志。采用改良神经元诱导液[Modified neuronal induction media(MNM)]定向诱导MSCs,免疫荧光检测神经细胞表面标志。观察胎牛血清(FBS)浓度、细胞密度、MNM剂量、新鲜与使用过的MNM等不同诱导微环境对MSCs成神经分化的影响。结果 MSCs经MNM诱导后,6h即可见尼氏体,表达神经元特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)和微管相关蛋白-2(MAP-2)。随着诱导微环境的改变,MSCs成神经分化率及神经元表面标志表达亦发生改变,且分化后的神经元样细胞可自发逆转。结论 MSCs能够在MNM微环境中定向成神经分化,但诱导微环境的改变可以从量和质两个层面影响MSCs定向分化。
- 龚敏毕杨江伟张小娟张赟魏小平陈洁刘友学李廷玉
- 关键词：骨髓间充质干细胞神经分化微环境
- AP2α重组腺病毒质粒的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达被引量：2
- 2012年
- 目的构建转录因子AP2α(Activator protein 2α)重组腺病毒质粒,感染大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymalstem cells,MSCs),并检测其表达。方法从大鼠PC12细胞总RNA中PCR扩增AP2α基因,定向克隆至腺病毒穿梭质粒pAdtrace-TOX,构建重组质粒,与腺病毒骨架质粒pAd-Easy1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-AP2α,转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad-AP2α,感染大鼠骨髓MSCs,荧光显微镜下观察RFP的表达;Real-time PCR及Western blot检测AP2α的表达。结果 pAdtrace-AP2α质粒经PCR及双酶切鉴定,均可见约1 400 bp的目的基因条带,测序结果与GenBank报道一致,并正确克隆至腺病毒质粒中;重组腺病毒pAd-AP2α在HEK293细胞中包装,病毒滴度可达2.6×108pfu/ml;感染MSCs 48 h可观察到60%以上的RFP阳性细胞,经Real-time PCR及Western blot鉴定,感染后72 h,MSCs中AP2α的表达显著增高(P<0.01)。结论成功构建了携带转录因子AP2α的重组腺病毒质粒,其能有效感染MSCs,增强MSCs中AP2α的表达。
- 毕杨龚敏何昀张赟陈洁陈洁
- 关键词：腺病毒载体骨髓间充质干细胞
- 显性负性突变体对AP2α转录因子及其活性的影响被引量：4
- 2011年
- 转录蛋白2α(activator protein-2α,AP2α)的转录活性可能是全反式视黄酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)促进骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)神经分化的关键调控点,但具体机制尚不清楚,显性负性突变是研究基因功能的一个经典手段.以携带AP2α全长基因的pAd-AP2α质粒为模板,分别扩增缺失bHLH及缺失TAD区域的AP2α片段,采用AdEasy腺病毒包装系统获得两种AP2α缺失型显性负性突变体重组腺病毒Ad-dnAP2α-△bHLH及Ad-dnAP2α-△TAD,腺病毒感染ATRA诱导24 h的大鼠MSCs可观察到60%以上RFP阳性细胞.Real-time-PCR、Western blot及免疫荧光结果显示AP2α定位于MSCs细胞核,经A-TRA诱导24 h,AP2α的表达无变化,而其下游基因bcl-2及c-kit表达增高,两种缺失型显性负性突变体腺病毒感染MSCs对野生型AP2α的mRNA及蛋白表达没有影响,却能有效抑制AP2α对下游靶基因bcl-2和c-kit的转录激活作用.为进一步研究AP2α转录活性在ATRA诱导MSCs成神经分化中的作用提供重要的分子手段.
- 毕杨何昀龚敏张赟陈洁李廷玉
- 关键词：腺病毒骨髓间充质干细胞
- 人脐带间充质干细胞的分离鉴定及其修复缺血缺氧脑损伤作用被引量：3
- 2011年
- 目的:研究人脐带间充质干细胞(UCMSCs)多向分化潜能,了解UCMSCs移植治疗脑缺血缺氧损伤(HIBD)大鼠的神经修复功能。方法:采用组织消化原代贴壁法分离培养人UCMSCs;取第4和10代UCMSCs进行流式细胞术检测间充质干细胞(MSCs)表面特异标志物表达;染色体分型检测染色体是否畸变;进行成神经、骨、脂诱导,了解其多向分化潜能;制备HIBD大鼠模型,穿梭箱测试对照组、HIBD细胞移植组和HIBD组大鼠的主动逃避率(AARR)和未逃避率(NARR)。结果:流式细胞术结果显示,类似MSCs样细胞强表达CD29、CD44和CD105,极低表达CD34和CD45,符合UCMSCs的特征。多向分化诱导后的细胞染色和免疫荧光结果显示,UCMSCs可诱导分化为神经样细胞、脂肪细胞和成骨细胞,多次传代后仍可多向诱导,且未发生染色体畸变。穿梭箱测试提示,UCMSCs移植组大鼠在测试的第3、4和5天的AARR高于HIBD组(P<0.05)。结论:UCMSCs易获取及纯化,具有多向分化潜能,多次传代功能稳定,可改善脑损伤动物的神经功能。
- 江伟沈洁史源龚敏瞿平张赟魏小平刘友学陈洁李廷玉
- 关键词：人脐带间充质干细胞多向分化穿梭箱
