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HPV基因芯片检测质控点设计和参数优化研究被引量：2: 2018年; 目的:设计人乳头状瘤病毒(HPV)基因芯片的质量控制点,优化质量控制探针和人β珠蛋白基因引物浓度以及HPV引物浓度比例,以提高基因芯片的检测质量。方法:收集临床HPV患者宫颈刮片样本,提取样本HPV58的DNA,用HPV通用引物扩增病毒DNA;利用人β珠蛋白引物扩增样本中的β珠蛋白DNA,将扩增的PCR产物与线性化的p MD18-T载体连接,构建人β珠蛋白和HPV58 L1区DNA质粒,转化大肠杆菌后,进行单克隆培养,获得HPV58样本和人β珠蛋白的DNA模板;以HPV58和人β珠蛋白DNA基因信息设计并制备扩增HPV和人β珠蛋白探针及PCR引物,将人β珠蛋白基因探针固定于基因芯片作为质量控制点(QC),按1∶20、1∶10、1∶5和1∶4比例混合单克隆HPV扩增引物与人β珠蛋白扩增引物,采用PCR反向点杂交技术,对模板进行扩增后,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的产量,进行基因芯片孵育杂交和显色;用扫描仪扫描芯片,采用Image J软件对各阳性杂交信号点进行信号强度采集,计算最佳的人β珠蛋白扩增引物和HPV扩增引物浓度比值;将QC的探针点样浓度设为0. 1 pmol/L、1 pmol/L、10 pmol/L、50 pmol/L和100 pmol/L,检测信号强度,优化质量控制探针点样浓度。结果:扩增了HPV58病毒DNA和人β珠蛋白的DNA模板,设计了HPV58和人β珠蛋白探针及PCR引物;琼脂糖凝胶电泳检测分析发现,当人β珠蛋白扩增引物与HPV扩增引物的浓度比例为1∶10时,二者同时PCR扩增时,扩增的强度较为一致,得到的产物量相当,用此引物浓度比例进行PCR获得的产物与测试芯片进行杂交,显色的平衡性较好;对QC的点样浓度进行测试发现,当QC点样探针浓度为50 pmol/L时,可以获得最佳的检测效果。结论:通过对β珠蛋白扩增引物与HPV扩增引物的最佳浓度比例和质量控制探针最佳点样浓度的优化,提高了HPV检测点的检测质量。; 兰金芝刘扬徐澍张金娟王欢肖俊江银辉陈腾祥; 关键词：人乳头状瘤病毒基因芯片引物 Β珠蛋白

细胞培养密度对MCF7细胞calpain2和FAK的水解及活性影响被引量：1: 2014年; 目的:探讨细胞培养密度对乳腺癌MCF7细胞钙激活中性蛋白酶2(calpain 2)和焦点黏附蛋白(FAK)的水解及活性的影响。方法:常规培养乳腺癌细胞MCF7,分别以1×106、5×106、1×107个细胞传代于不同的6 cm皿中,培养36 h后,形成不同的培养密度(分别为低密度、正常密度和高密度),裂解细胞,提取蛋白行Western blot检测calpain 2和FAK的表达,用磷酸化抗体检测FAK的Y397位点磷酸化水平;MCF7细胞高密度培养并calpain 2抑制剂处理后,用Western blot法检测FAK水解情况和磷酸化水平。结果:不同密度培养对calpain 2的表达没有明显影响,但可影响calpain 2的水解,培养密度加大,水解程度加强;培养密度也可以影响FAK的水解模式,低密度培养细胞的FAK以较大的水解片段为主,高密度培养的FAK则以较小片段为主,高密度培养细胞FAK Y397磷酸化水平比低密度的低;给予calpain 2特异性抑制剂后,高密度培养细胞FAK大片段增多,小片段减少,其Y397位点的磷酸化水平增高。结论:细胞高密度培养可使MCF7细胞calpain 2的活性增强,FAK的水解程度加大,降低FAK的磷酸化。; 陈腾祥霍建云王宁王金利王晋星一陈妮陈林崔唱张金娟毛大华胡晓霞; 关键词：钙激活中性蛋白酶细胞密度细胞培养

钙激活中性蛋白酶在肝癌细胞迁移能力中的作用被引量：2: 2011年; 目的:观察不同转移能力肝癌细胞中钙激活中性蛋白酶(calpain)的表达情况,利用抑制剂抑制cal-pain活性,评价calpain对肝癌细胞迁移能力的影响。方法:用蛋白质印迹(Western blotting)检测不同转移能力肝癌细胞或肝细胞中calpain-1、calpain-2和Src的表达和酶解情况;用划痕法观察calpain-2抑制剂对高转移性肝癌细胞(MHCC97-H)迁移能力的影响。结果:Western blot结果显示,不同肝细胞系中calpain-1、calpain-2及Src的表达水平和剪切成为低分子量(LMW)活性形式的程度不一样,其中calpain-2和Src的表达与肝癌细胞的迁移能力有相关性,calpain-2抑制剂明显下调MHCC97-H细胞中calpain-2和Src的表达,减少其被剪切的程度;划痕实验结果显示,calpain-2抑制剂能明显减少MHCC97-H细胞向划痕区域迁移,而且抑制剂浓度越大,细胞迁移能力被抑制的程度就越重。结论:calpain-2的表达上调和活性增强可通过激活Src增加肝癌细胞的迁移能力。; 唐佳艳洪阳向敏郑洋王艳胡晓霞潘娅王旭东周力陈腾祥; 关键词：肝癌细胞钙激活中性蛋白酶细胞迁移

钙激活中性蛋白酶在肝癌细胞迁移能力中的作用的研究: 目的观察不同转移能力肝癌细胞中钙激活中性蛋白酶(calpain)的表达情况,利用抑制剂抑制calpain活性,评价calpain对肝癌细胞迁移能力的影响。方法用蛋白质印迹(Western blot)检测转移能力肝癌细胞或...; 唐佳艳洪阳向敏郑洋王艳胡晓霞王旭东周力陈腾祥; 关键词：肝癌细胞钙激活中性蛋白酶细胞迁移; 文献传递

阿霉素对肝癌细胞系MHCC97-L中Wnt5b和Nanog表达的影响被引量：1: 2012年; 目的:探讨干细胞相关基因Wnt5b和Nanog在阿霉素(ADM)作用下的人低转移性肝癌细胞系MH-CC97-L中的表达。方法:MHCC97-L细胞常规培养,用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测ADM作用72 h时MHCC97-L的半数致死量(LD50);蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测ADM(LD50)作用下,干细胞相关基因Wnt5b和Nanog蛋白表达。结果:MTT实验结果显示,ADM对MHCC97-L的半数致死量(ID50)为0.423 3μmol/L;Western blot检测发现,在ADM(ID50)作用下,随作用时间延长,Wnt5b蛋白表达水平逐渐增高,12 h时达最高峰(P<0.05),以后则逐渐降低,72 h时降到最低(P<0.05);在ADM(ID50)作用下,随作用时间延长,Nanog蛋白表达水平逐渐降低,12 h时降到最低,以后则逐渐升高,72 h时达到最高(P<0.05)。结论:干细胞相关基因Wnt5b、Nanog在ADM作用下的人肝癌细胞系MHCC97-L中均有不同程度的表达。; 郑洋潘娅洪阳向敏王寒琪王燕陈腾祥; 关键词：肝细胞阿霉素干细胞基因

组蛋白乙酰化水平对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响被引量：4: 2017年; 目的:观察人肝细胞株LO2及不同转移能力的肝癌细胞株Hep G2、MHCC-97L和LM3中组蛋白H3K9、H4K12及H4K16位点的乙酰化水平,并探讨组蛋白乙酰化对肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响。方法:采用Western blot实验检测LO2、Hep G2、MHCC-97L和LM3中组蛋白H3K9、H4K12及H4K16乙酰化水平;应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺他(SAHA,1.5μmol/L和3μmol/L)处理肝癌LM3细胞株24 h、48 h后,Western blot检测其组蛋白H3K9、H4K12及H4K16乙酰化水平变化,transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力的变化。结果:H3K9、H4K12及H4K16乙酰化水平由高到低为Hep G2、MHCC-97L、LM3,3种肝癌细胞株的乙酰化水平均低于人肝细胞LO2(P<0.05);去乙酰化酶抑制剂SAHA作用后,LM3细胞组蛋白H3K9、H4K12及H4K16乙酰化水平明显提高,细胞的迁移、侵袭能力明显降低,与未用SAHA处理的LM3细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:提高组蛋白H3K9、H4K12、H4K16位点的乙酰化水平,能抑制肝癌细胞的迁移、侵袭能力。; 刘伟肖俊兰金芝曾智锐雷珊张金娟陈腾祥; 关键词：肝癌组蛋白乙酰化迁移

肝癌模型大鼠癌组织组蛋白乙酰化水平观察被引量：3: 2017年; 目的:观察肝癌模型大鼠癌组织中组蛋白H3K9、H4K12、H4K16位点的乙酰化水平。方法:50只大鼠随机分为模型组(40只)及对照组(10只),予模型组大鼠2.5 g/L二乙基亚硝胺(DEN)溶液自由饮用14周建立肝癌模型,对照组大鼠自由饮用灭菌食用水;造模结束后,取肝组织镜下观察,确认造模成功,采用免疫组织化学及Western blot检测肝癌组织中组蛋白H3K9、H4K12及H4K16乙酰化水平。结果:造模过程中模型组大鼠死亡20只,另20只大鼠肝组织肝小叶结构破坏,假小叶形成,在11个标本中可见肝癌细胞;免疫组织化学染色及Western Blot检测结果显示,模型大鼠肝癌组织组蛋白H3K9、H4K12及H4K16位点乙酰化水平均低于对照组大鼠肝组织(P<0.05)。结论:DEN诱导的肝癌模型大鼠肝癌组织组蛋白H3K9、H4K12及H4K16位点的乙酰化水平均明显降低,提示组蛋白H3K9、H4K12、H4K16位点的低乙酰化可能参与了肝癌的发生。; 刘伟肖俊兰金芝曾智锐雷珊张金娟陈腾祥; 关键词：肝癌组蛋白乙酰化

钙激活中性蛋白酶-2对整合素β4水解的影响被引量：3: 2015年; 目的:观察乳腺癌细胞系MCF7细胞中,钙激活中性蛋白酶2(calpain-2)对整合素(integrin)β4水解的影响。方法:利用"短发夹"RNA(shRNA)和微小RNA(mirRNA)技术结合的calpain-2基因沉默(gene silencing)慢病毒质粒(GIPZ lentiviral shRNAmir)转染乳腺癌细胞株MCF7,嘌呤霉素筛选稳定沉默calpain-2基因的细胞株,细胞株传4代,用荧光显微镜观察转染效率,用蛋白质印迹(Western blot)实验检测calpain-2基因沉默效率及integrinβ4水解的情况。结果:嘌呤霉素筛选、细胞传4代,荧光显微镜下观察显示转染和筛选后,EGFP表达阳性的MCF7细胞的比例分别达到(95.6±2.6)%(空shRNAmir载体)、(97.1±1.7)%(Calpain-2 shRNAmir1)和(97.7±0.2)%(Calpain-2 shRNAmir 2),差异无统计学意义(P>0.05);Western blot结果显示,基因沉默的MCF7细胞中calpain-2的表达被明显抑制,相对于空shRNAmir载体转染的MCF7细胞,差异有统计学意义(P<0.01),calpain-2的表达下调到21.5%(Calpain-2 shRNAmir 1)和18.8%(Calpain-2 shRNAmir 2),空shRNAmir载体转染的MCF7细胞中calpain-2的表达与未转染的MCF7细胞比较,差异无统计学意义(P>0.05);比较calpain-2基因沉默和空shRNAmir载体转染的MCF7细胞,发现integrinβ4均被水解,水解片段的分子量主要有200 k D、130和95 k D;calpain-2基因沉默后,calpain-2基因沉默MCF7细胞中200 k D的水解片段比空shRNAmir载体转染的MCF7细胞减少(P<0.01)。结论:在乳腺癌细胞MCF7中,calpain-2可能参与integrinβ4的200 k D片段的形成,从而参与调整integrinβ4的构象变化。; 胡晓霞霍建云张金娟潘娅王晋星一陈妮张祥令陈腾祥; 关键词：乳腺肿瘤蛋白水解基因沉默

细胞培养密度对MCF7乳腺癌细胞integrin β4水解的影响被引量：2: 2015年; 目的:研究细胞培养密度对MCF7乳腺癌细胞integrinβ4水解机制。方法:常规培养高密度和低密度MCF7乳腺癌细胞,分别给予钙离子螯合剂和肝素处理,用Western blot检测不同培养密度MCF7细胞integrinβ4的水解情况;用Fluo-3 AM作为钙离子荧光探针,激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内钙离子的分布。结果:Western blot检测结果显示,在低密度和高密度培养的MCF7细胞中,integrinβ4的水解模式不同;在高浓度培养的细胞中,200 k D integrinβ4片段产生增多;激光共聚焦扫描显微镜观察发现,低密度培养MCF7细胞中,钙离子的绿色荧光主要成团或颗粒状分布,而且与红色荧光有较多的重合,部分钙离子分布于细胞核内;在高密度培养的细胞中,钙离子在细胞质膜和细胞核中的定位较少;钙离子螯合剂BAPTA-AM处理可使200 k D integrinβ4明显减少;10-6mol/L的肝素能够减少MCF7细胞200 k D水解片段的增多,随着肝素浓度的增高,抑制效果有所增强;相对于BAPTA-AM,10-4mol/L肝素的抑制效应减弱。结论:高密度培养的MCF7细胞中,钙离子从钙库中释放,细胞外内流增多,激活calpain 2,导致200 k D integrinβ4水解片段增多。; 严莉莎霍建云董宇华潘娅王晋星一陈妮臧贵勇胡晓霞陈腾祥; 关键词：钙离子肝素

雌二醇对三阴乳腺癌细胞integrin β4水解作用的影响被引量：3: 2015年; 目的:研究三阴乳腺癌(TNBC)MDA-MB-231细胞中雌二醇对整合素(integrin)β4水解的促进作用。方法:常规培养MDA-MB-231细胞至指数增长期,分别给予17β-雌二醇、雌激素受体(ER)特异性阻断剂4-羟基他莫西芬(OHT)和G蛋白偶联受体30(GPR30)特异性阻断剂G-15干预30 min,采用蛋白质印迹(Western blot)实验检测钙激活中性蛋白酶2(calpain 2)的表达和integrinβ4水解的情况。结果:17β-estradiol在短时间内可促进MDA-MB-231细胞130和95k D integrinβ4水解片段的产生,促进作用呈浓度依赖方式,而对calpain 2表达没有明显影响;4-OHT不能阻断17β-estradiol对integrinβ4的水解作用,且其本身可促进integrinβ4水解;G-15能阻断17β-estradiol对integrinβ4的水解。结论:在TNBC MDA-MB-231细胞中,17β-estradiol可通过GPR30促进130和95k Dintegrinβ4水解片段的产生。; 陈腾祥严莉莎霍建云张金娟潘娅王晋星一陈妮臧贵勇胡晓霞; 关键词：三阴乳腺癌

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