江苏省社会发展科技计划(BS2006522)
- 作品数：6 被引量：10H指数：2
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- 马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、序列分析及编码产物B细胞表位预测被引量：3
- 2009年
- 根据GenBank中马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(BmG3PD基因)序列设计引物,以马来丝虫mRNA为模板,RT-PCR扩增BmG3PD基因,将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及PCR鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmG3PD,经序列分析及同源性比较,以及对其编码产物进行B细胞表位预测,结果表明PCR扩增的特异性条带为1020bp,与预期相符,与GenBank已知基因序列同源性为99%。编码产物B细胞表位预测,氨基酸区域可能在22～36、242～255、303～318和326～336位。
- 谢东方方政童海燕徐邦生黄为群方浩沈勤
- 关键词：马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因克隆B细胞表位
- 周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的克隆与真核表达被引量：4
- 2008年
- 目的克隆和表达周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶（BmGAPDH）的编码基因。方法依据公布的BmGAPDH基因序列设计引物，以周期型马来丝虫总RNA为模板，反转录PCR（RT-PCR）扩增目的编码基因。PCR产物经TA克隆后，克隆至载体pGEM-TEasy中，经PCR和双酶切鉴定后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋），构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）／BmGAPDH，转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）对获得重组蛋白（rBmGAPDH）进行分析和鉴定。结果转染的COS-7细胞高水平表达BmGAPDH的mRNA，根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的结果一致。SDS-PAGE分析显示重组蛋白rBmGAPDH相对分子质量（Mr）约为43000。结论成功进行了BmGAPDH编码基因的克隆和真核表达。
- 谢东方方政黄为群沈勤童海燕徐邦生
- 关键词：周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶真核表达载体COS-7细胞
- 马来丝虫肌球蛋白基因序列及编码产物预测被引量：1
- 2009年
- 目的克隆周期型马来丝虫肌球蛋白（BmMyosin）基因,进行序列测定、分析及编码产物的B细胞表位预测。方法依据公布的BmMyosin基因序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,反转录PCR（RT-PCR）扩增目的编码基因。扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠埃希菌（E.coli）DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmMyosin,经测序验证,并进行同源性比较。应用5种参数和方法对其编码产物进行B细胞表位预测。结果RT-PCR扩增出一条约1 292 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为98.45%。经表位预测分析,BmMyosin的B细胞表位可能在287-300位、339-350位和416-422位氨基酸区域。结论成功构建了周期型马来丝虫肌球蛋白重组质粒pGEM-T克隆载体,对其编码产物进行B细胞表位预测。为蛋白质特性分析及免疫学研究提供基础依据。
- 谢东方方政童海燕徐邦生黄为群沈勤
- 关键词：周期型马来丝虫肌球蛋白基因克隆B细胞表位
- 周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因真核表达载体的构建及DNA免疫研究被引量：2
- 2009年
- 目的构建周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶（BmGAPDH）真核表达载体pcDNA3．1-BmGAPDH，并观察其在小鼠体内的细胞免疫应答效应。方法以周期型马来丝虫总RNA为模板，RT—PCR方法扩增目的基因片段。与pGEM—TEasy克隆载体连接，筛选出阳性克隆，经PCR和双酶切鉴定后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3．1，构建pcDNA3．1-BmGAPDH表达载体，将纯化的pcDNA3．1-BmGAPDH和CpG经后腿胫前肌免疫BALB／c小鼠，并设PBS对照组及空质粒对照组，共免疫3次，每次免疫间隔2周。用RTPCR方法检测肌肉组织内目的基因；用噻唑蓝（MTT）法、ELISA方法分别检测免疫小鼠T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中细胞因子IFN-γ、IL-4水平。应用SPSS统计学软件进行样本均数的t检验。结果成功构建了pcDNA3．1-BmGAPDH真核表达载体，基因片段全长为1020bp，DNA序列分析与基因库已知基因序列同源性为99％。该真核表达载体免疫小鼠后，从小鼠肌肉组织扩增出目的基因重组质粒组小鼠淋巴细胞刺激增殖指数显著高于PBS对照组及空质粒对照组，淋巴细胞刺激增殖指数分别为1．398、1．006和1．017（P〈0．05）。重组质粒组IFN-γ、IL-4细胞因子水平均高于PBS对照组及空质粒对照组，分别为163．905、58．589、51．317ng／L和107．906、27．111、34．627ng／L（P〈0．05）。免疫佐剂CpG与疫苗同时注射可增强机体的免疫应答，表现为IFN-γ水平和免疫4周后淋巴细胞刺激增殖指数显著上升。结论pcDNA3．1Bm GAPDH真核表达载体能在小鼠体内表达并可诱导相关的细胞免疫应答。
- 童海燕方政谢东方黄为群方浩徐邦生
- 关键词：甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因表达DNA
- 马来丝虫肌球蛋白部分编码基因Bm-M55的克隆与真核表达被引量：2
- 2008年
- 根据马来丝虫肌球蛋白部分编码基因(Bm-M55)序列设计引物,以其微丝蚴总RNA为模板,反转录PCR扩增目的基因。用TA克隆方法将目的基因克隆至载体pGEM-TEasy中,经PCR和双酶切鉴定并测序后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/Bm-M55,转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)对获得重组蛋白Bm-M55进行分析和鉴定。RT-PCR鉴定结果显示,转染的COS-7细胞表达了Bm-M55基因,根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank(登录号为AAA27858)中的一致,重组蛋白Bm-M55相对分子质量(Mr)约为55000。
- 谢东方方政黄为群沈勤童海燕徐邦生
- 关键词：马来丝虫肌球蛋白真核表达载体COS-7细胞
