北京市自然科学基金(5102037)
- 作品数：5 被引量：3H指数：1
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- 重组小鼠血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和纯化
- 2012年
- 目的:建立毕赤酵母重组小鼠血管内皮生长因子(mVEGF)的制备方法,为研究mVEGF的生物活性、抗原性等提供基础。方法:通过全基因合成方法获得编码mVEGF的基因片段,将其克隆至表达载体pPICZαA上,电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,用甲醇诱导表达目的蛋白,表达上清经硫酸铵沉淀、Sephadex G25柱脱盐、阳离子交换层析三步纯化获得目的蛋白;用还原型和非还原型SDS-PAGE检测目的蛋白的聚体状态,用Western印迹验证纯化蛋白;通过PNGase F酶切分析目的蛋白的N-糖基化修饰;通过人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验检测目的蛋白的生物活性。结果:获得mVEGF的重组毕赤酵母表达菌株,SDS-PAGE分析可见GS115表达的重组mVEGF在还原状态下表观相对分子质量约为20×103,在非还原状态下约为40×103;经Western印迹检测,这些条带均为目的蛋白条带,能被兔抗mVEGF抗体特异性结合,PNGase F酶切后相对分子质量降至18×103左右,证明目的蛋白发生了N-糖基化修饰;细胞测活实验表明,mVEGF具有刺激HUVEC增殖的生物活性。结论:利用毕赤酵母菌制备了具有生物活性的重组mVEGF。
- 李海燕刘波唱韶红巩新徐威吴军
- 关键词：毕赤酵母重组蛋白N-糖基化
- 拟南芥甘露糖苷酶Ⅰ和人N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ的原核表达及其多克隆抗体制备
- 2012年
- 目的:在大肠杆菌中分别重组表达拟南芥甘露糖苷酶Ⅰ(ATMDSI)和人N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(HsGnTI),制备其多克隆抗体,为基因表达鉴定提供检测抗体。方法:用PCR方法克隆ATMDSI、HsGnTI基因片段,连接至pBV220表达载体后转化大肠杆菌DH5α,获得表达菌株,通过42℃升温诱导表达,制备纯化ATMDSI和HsGnTI;纯化的蛋白以80μg/kg的剂量免疫大耳白兔,经3次免疫后,采集血清制备其相应的多克隆抗体;采用Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果:获得ATMDSI和HsGnTI基因片段,并构建了其相应的原核表达载体pBV220-ATMDSI、pBV220-HsGnTI,在大肠杆菌中表达了重组ATMDSI和HsGnTI,SDS-PAGE分析显示其相对分子质量分别为45.3×103和46.9×103,与理论值一致;用纯化的蛋白免疫大耳白兔后制备了抗ATMDSI、HsGnTI多克隆抗体,Western印迹结果证明该抗体具有较高的特异性。结论:获得了特异性较高的抗ATMDSI、HsGnTI多克隆抗体血清,为甘露糖苷酶Ⅰ和N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ的研究提供了检测抗体。
- 胡晓巩新唱韶红何建勇吴军刘波
- 关键词：原核表达多克隆抗体
- 利用伴刀豆球蛋白检测O-甘露糖基化被引量：1
- 2011年
- 目的:基于伴刀豆球蛋白A(ConA)特异性识别并结合甘露糖的特性,建立一种检测O-甘露糖基化的方法,为酵母等宿主表达蛋白的O-糖基化提供一种高效筛选和分析的方法。方法:利用糖苷酶F(PNGF)切除检测蛋白的N-糖链,排除N-糖基化的干扰;通过Q阴离子交换柱和ConA Sepharose 4B柱纯化Western印迹膜封闭蛋白牛血清白蛋白(BSA),除去BSA中甘露糖修饰的蛋白的干扰,优化膜封闭条件;利用辣根过氧化物酶标记的ConA检测具有低甘露糖型N-糖基化修饰能力的毕赤酵母GJK01-HL(Δoch1)表达的抗Her-2抗体是否存在O-甘露糖基化现象。结果:通过PNGF酶切处理,可以完全去除糖蛋白的N-糖链的干扰;BSA经过Q阴离子交换柱和ConASepharose 4B柱纯化后,除去了大部分甘露糖蛋白,可作为封闭蛋白;用建立的方法检测,发现毕赤酵母工程菌GJK01-HL(Δoch1)表达的抗Her-2抗体存在O-甘露糖基化现象。结论:本方法是研究糖蛋白是否发生O-甘露糖基化的有效检测手段,可用于酵母等表达蛋白的O-糖基化的高效筛选和分析。
- 李思强巩新唱绍红吴军刘波高国龙
- 关键词：伴刀豆球蛋白A
- 大肠杆菌N~α-乙酰基转移酶RimI对人胸腺素α原N末端乙酰化修饰的影响
- 2011年
- 目的:研究大肠杆菌Nα-乙酰基转移酶RimI对人胸腺素α原(ProTα)N末端乙酰化修饰的影响。方法:在大肠杆菌中共表达ProTα与大肠杆菌Nα-乙酰基转移酶RimI,同时设置只表达ProTα的对照菌,分别提取纯化ProTα,利用HPLC检测其发生乙酰化修饰的程度。结果:ProTα的乙酰化修饰发生在翻译后水平,有无RimI的过表达、诱导时间的长短以及这两个因素之间的交叉效应均对ProTα的乙酰化程度有影响,其F值分别为53.8、89.22及16.28,P值均小于0.0001;无论有无RimI过表达,乙酰化的ProTα所占比例在诱导6 h后逐渐升高(P<0.0001);在过表达Ri-mI的菌株中,乙酰化的ProTα在诱导12 h后占37.4%,而在无RimI过表达的菌株中占64.3%;RimI对ProTα乙酰化的抑制作用从诱导6 h后开始显现(P=0.0007)。结论:在大肠杆菌中,过量的Nα-乙酰基转移酶RimI可抑制人胸腺素α原的乙酰化修饰。
- 孙鹏巩新唱韶红马清钧吴军刘波
- 关键词：大肠杆菌
- 甲型H1N1流感病毒血凝素HA1在糖基工程毕赤酵母中的表达被引量：2
- 2012年
- 目的:建立用糖基工程酵母制备流感血凝素的方法 ,研究其免疫原性,为酵母表达流感疫苗提供基础。方法:通过PCR的方法扩增编码H1N1流感病毒血凝素HA1(1～330 aa)的基因片段,将HA1基因克隆到表达载体pPIC9质粒上,电转化到糖基工程酵母中,甲醇诱导表达并用镍亲和层析柱纯化重组蛋白,N-糖苷酶F(PNGF)酶切分析N-糖链,Western印迹验证纯化蛋白,免疫小鼠并测定HA1诱导抗体的滴度。结果:获得HA1基因的酵母重组表达菌株,SDS-PAGE分析可见野生型GS115表达的重组HA1相对分子质量约为100×103,而糖基工程酵母GJK01表达的HA1约为60×103,PNGF酶切后相对分子质量均降至45×103左右;经Western印迹检测,这些条带均为目的蛋白条带,野生型和糖基工程酵母表达的HA1分子大小不同是由于不同的N-糖基化修饰引起的。重组HA1免疫小鼠可产生抗HA1抗体,随着抗原剂量的增加,其产生的抗体滴度相应增加;3次免疫后,4μg HA1诱导小鼠产生的抗体滴度最高。结论:利用糖基工程酵母表达制备了低糖化的流感病毒血凝素HA1,该重组蛋白可以诱导小鼠产生HA1抗体,且产生的抗体滴度具有HA1剂量依赖性。
- 张晓红刘波巩新唱韶红徐威吴军
- 关键词：H1N1流感病毒血凝素N-糖基化
