海外青年学者合作研究基金(30228029)
- 作品数：9 被引量：20H指数：3
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- 大鼠耳蜗大上皮嵴及小上皮嵴细胞永生细胞系的建立被引量：2
- 2006年
- 目的：建立大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生细胞系。方法：取P1大鼠耳蜗，分离出耳蜗上皮薄片组织，并与含SV40-LT抗原的逆转录病毒共培养，从而实现细胞的永生化。利用单克隆法纯化细胞系，并通过形态学、免疫组织化学等方法对细胞系进行鉴定。结果：大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生细胞系基本保持了细胞原代的表型特征：呈现上皮细胞样的多角形外观；不同世代的细胞均表达Isletl及SV40-LT抗原。该系目前已培养3个月，超过20代，传代时间为3～4d，传代比例为1：5。结论：本实验成功建立了大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞的永生细胞系，这为大、小上皮嵴细胞生物学特性及相关功能，特别是毛细胞再生及前体细胞移植治疗感音神经性聋方面的研究奠定了坚实的实验基础。
- 张媛郭维维宋巍郑贵亮翟所强
- 关键词：耳蜗大上皮嵴永生细胞系
- 新生大鼠耳蜗基底膜上皮细胞层的分离:酶消化与机械解剖可否使分离部分细胞失去活性
- 2005年
- 目的:探讨利用酶消化和机械解剖相结合方法分离新生大鼠耳蜗上皮细胞层的方法。方法:实验于2003-02/06在解放军总医院耳鼻咽喉科研究所进行。取新出生SD大鼠耳蜗基底膜后,将其放入含有嗜热菌蛋白酶的D-Hank溶液中,37℃孵箱孵育25min进行酶消化,然后在高倍显微镜下应用自制的超细钨丝刀进行显微机械分离。对分离的耳蜗上皮细胞层进行半薄切片硼砂甲苯胺蓝染色与耳蜗冰冻切片苏木精-伊红染色进行形态对比。结果:①分离后的耳蜗基底膜上皮层在显微镜下呈透明的薄片样组织,其内的各种细胞形态保持完好。②硼砂甲苯胺蓝染色与苏木精-伊红染色进行形态比较发现,分离的耳蜗基底膜上皮层只含有基底膜上的上皮组织,包括耳蜗感觉上皮和非感觉上皮,即只有内毛细胞、外毛细胞、小上皮嵴、大上皮嵴和支持细胞,是纯净的上皮组织而没有任何的结缔组织。结论:利用37℃和25min时间的酶消化法及机械解剖相结合的实验技术可以分离出纯粹的耳蜗上皮细胞层,为进一步纯化上皮内的各种细胞,进行各种基因转染试验以及耳蜗内的各种基础实验建立细胞模型并提供有效地实验手段。
- 宋巍胡吟燕郭维郑贵亮翟所强
- 关键词：耳蜗上皮细胞嗜热菌蛋白酶细胞分离
- 大鼠耳蜗大上皮嵴细胞体外培养的实验观察被引量：3
- 2007年
- 目的建立大鼠耳蜗大上皮嵴(greater epithelial ridge,GER)细胞体外培养体系,探讨其在离体培养条件下的生物学特性、生长模式及超微结构。方法取生后1d 大鼠耳蜗,利用机械分离和酶消化相结合的方法分离出纯 GER 细胞,分别于无血清和含10%胎牛血清的 DMEM 培基中进行培养,观察细胞生长特性,并对培养物进行溴脱氧尿苷(BrdU)、鬼笔环肽(phalloidin)、ZO1、钙视网膜蛋白(calretinin)及肌球蛋白 VIIa(myosin VIIa)免疫组化鉴定及扫描电镜观察。结果 GER 体外培养细胞呈现典型的上皮样多角形外观,细胞间连接紧密,具有明显的增殖能力,在含血清培养基中易形成贴壁细胞岛,而在无血清培养条件下则易形成悬浮细胞球。GER 细胞呈现 BrdU、phalloidin 以及ZO1染色的阳性反应,而 calretinin 及 myosinVIIa 则表现为阴性。扫描电镜显示 GER 细胞表面可见微绒毛和中心体,但未见毛细胞特异性结构纤毛束。结论 GER 体外培养细胞具有增殖能力,在不同培养条件下可分别呈现贴壁细胞岛及悬浮细胞球生长特性,GER 细胞表达上皮细胞来源标记物,但不表达毛细胞特异性标记物。
- 张媛孙建和胡吟燕郑贵亮翟所强
- 关键词：耳蜗细胞细胞培养技术
- Hath1基因诱导新生大鼠大上皮嵴细胞形成毛细胞样细胞被引量：2
- 2008年
- 目的探讨Hathl（human atonal homolog 1）基因对大鼠耳蜗大上皮嵴（greater epithelial ridge，GER）细胞的诱导分化作用。方法取出生后1d大鼠耳蜗，利用酶消化和机械分离相结合的方法分离出GER细胞，并行体外培养。以腺病毒为载体，对GER细胞培养物进行Hath1基因和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因（ad—Hath1-EGFP）的转染，单纯转染EGFP（ad-EGFP）作为对照组，对感染后不同天数的标本行毛细胞特异性标记物myosin Ⅶa免疫组化染色鉴定。结果ad-Hath1—EGFP组中的GER细胞中出现了myosin Ⅶa和EGFP双标记细胞，并且从感染后第5天开始出现myosin Ⅶa阳性细胞，随后阳性细胞的数量有所增加，但增加不明显；而adEGFP组感染后3～12d的GER标本均未见myosinWa阳性细胞。结论GER细胞可能是耳蜗毛细胞的前体细胞，Hath1基因过表达可以诱导GER细胞向毛细胞样细胞（myosin Ⅶa阳性）分化。
- 张媛胡吟燕郭维翟所强
- 关键词：耳蜗
- 大鼠耳蜗毛细胞前体细胞与耳蜗间质细胞共培养的实验研究被引量：8
- 2007年
- 目的探讨耳蜗间质细胞对耳蜗毛细胞前体细胞——大上皮嵴(greater epithelial ridge,GER)细胞的诱导分化作用。方法取出生后第1天大鼠20只,随机分为2组,每组各10只,利用酶消化和机械分离相结合的方法分别分离出纯耳蜗GER细胞和耳蜗间质细胞,并进行体外混合培养及形态学的观测,对共培养10天的标本行抗Calretinin(标记幼稚毛细胞)及抗p27抗体(标记支持细胞)的免疫细胞组织化学染色鉴定。结果混合培养的耳蜗GER细胞和间质细胞易形成片状细胞岛,共培养10天后,有部分细胞表达Calretinin,亦有少数细胞表达p27,但无Calretinin及p27双标记者。结论GER细胞与耳蜗间质细胞共培养,可以诱导GER细胞分化为毛细胞及支持细胞表型。
- 张媛郭维胡吟燕郑贵亮翟所强
- 关键词：毛细胞再生前体细胞大上皮嵴间质细胞
- Hath1基因转染后大鼠耳蜗毛细胞前体细胞的扫描电镜观察被引量：2
- 2006年
- 目的探讨Hath1基因对大鼠耳蜗大上皮嵴(greaterepithelialridge,GER)细胞的诱导分化作用。方法取出生后第1天的大鼠耳蜗,利用机械分离和酶消化相结合的方法分离出纯的GER细胞,于含10%血清DMEM培基中进行培养。以腺病毒为载体对GER培养物进行Hath1基因的转染,并对感染后10天的标本进行扫描电镜观察。结果扫描电镜观察显示GER细胞在含10%血清DMEM培基中呈片状贴壁生长特性,表现为典型的上皮样多角型外观。Hath1感染后10天的GER细胞培养物可见在细胞团的边缘出现了细丝状纤毛样结构,而无病毒感染对照组未见到该结构。结论GER细胞作为毛细胞前体细胞可以实现体外原代培养,在Hath1基因重表达情况下,部分细胞的表面可见不成熟的纤毛样结构,提示Hath1基因也许可以诱导离体培养下的纯的毛细胞前体细胞向毛细胞的初步分化。
- 张媛孙建和郭维胡吟燕翟所强
- 关键词：毛细胞纤毛
- 大鼠耳蜗大上皮嵴的分离和鉴定被引量：4
- 2005年
- 目的:探讨利用酶消化和机械解剖相结合分离大鼠耳蜗大上皮嵴(GER)的方法。方法:取出生后0～3d的SD大鼠耳蜗基底膜后,将其放入含有嗜热菌蛋白酶和少许DNA酶的DHank溶液中,37℃孵箱孵育25min进行酶消化,然后在高倍显微镜下进行显微机械分离;对分离的GER细胞用免疫组织化学和RTPCR扩增GER细胞特异性表达基因Hes1的方法进行鉴定,并进行GER的原代培养以验证其活性。结果:免疫组织化学染色表明分离的GER细胞是单一的上皮组织;对Hes1基因进行RTPCR分析表明,分离的GER细胞表达该基因;分离的GER具有活性并可以进行原代培养。结论:利用酶消化和机械解剖相结合的方法可以分离出纯粹的有活性的GER,为进一步建立GER细胞系,进行各种基因转染试验以及耳蜗内的各种基础实验建立细胞模型提供有效的实验手段。
- 宋巍胡吟燕郭维郑贵亮翟所强高维强
- 关键词：耳蜗大上皮嵴嗜热菌蛋白酶
- 哺乳动物内耳毛细胞再生研究现状被引量：2
- 2006年
- 由毛细胞损伤引起的感音神经性聋至今尚无有效的治疗方法。诱导产生新生的有功能的毛细胞是恢复听力的重要途径。近年来,对哺乳动物毛细胞再生的研究取得了许多进展。本文旨在对哺乳动物内耳毛细胞再生的研究现状做一综述。
- 张媛翟所强
- 三种基因转录因子在大鼠耳蜗大上皮嵴的表达被引量：2
- 2005年
- 目的检测Math1、Hes1及Hes5在大鼠耳蜗大上皮嵴(greaterepithelial ridge,GER)的表达,初步探讨各基因对毛细胞分化和再生的作用。方法分别取出生当天(P0),出生后第1天(P1)、第3天(P3)、第4天(P4)和第5天(P5)大鼠耳蜗,利用机械分离和酶消化相结合的方法分离出相对纯化的GER细胞。Trizol法提取GER细胞总RNA,逆转录聚合酶链反应检测Math1、Hes1及Hes5在GER的表达,琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果Math1在P0～P5大鼠GER均有表达,Hes1只在P0～P3大鼠GER有表达,而Hes5在P0～P5大鼠GER中均无表达。结论Math1的表达水平可能只有累积至一定量,才能诱导GER增殖、分化成毛细胞,并且此过程可能同时受Hes1的控制。
- 张媛胡吟燕宋巍郭维维翟所强
- 关键词：逆转录聚合酶链反应耳蜗上皮聚合酶链反应检测琼脂糖凝胶电泳
